龍膽苦苷基于尿酸轉(zhuǎn)運蛋白和NLRP3炎性小體信號通路 改善小鼠高尿酸血癥和腎臟炎癥

區(qū)淑雅，李燦濤，邵穎穎，謝保城，胡潤凱（廣東省東莞市人民醫(yī)院，廣東 東莞 523000）

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）的直接誘因是人體嘌呤代謝紊亂造成體內(nèi)尿酸生成過多或排泄不足，可引發(fā)腎結(jié)石和間質(zhì)性腎炎等腎臟損傷[1]。目前，高尿酸血癥與高血壓、高血糖、高血脂并稱為“四高”代謝性疾病[2]。尿酸（uric acid，UA）是來源于動物嘌呤的最終產(chǎn)物，主要在肝臟合成，經(jīng)腎臟排泄[3]。隨著社會生活水平的提高，人們在日常飲食中往往會攝入過量的嘌呤，造成體內(nèi)尿酸濃度過高而增加患高尿酸血癥的風險。同時，尿酸可誘導炎癥介質(zhì)的分泌，增加促炎因子的生成和釋放，上調(diào)腎臟炎癥水平，造成腎臟的炎性損傷[4]。臨床上治療高尿酸血癥的臨床藥物主要有三類：黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）抑制劑、尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運蛋白1（urate anion transporter 1，URAT1）抑制劑和尿酸氧化酶類似物，這類藥物對肝、腎和腸道的不良反應嚴重影響患者的康復進程和生活質(zhì)量[5-6]。因此，尋找有效、不良反應少的高尿酸血癥治療藥物顯得尤為重要。

中醫(yī)目前對高尿酸血癥無統(tǒng)一的辨證標準，有中醫(yī)學家綜合臟腑、經(jīng)絡、病因病機等因素，將高尿酸血癥的證型歸為濕熱蘊結(jié)，故常用具有清利濕熱功效的中藥進行治療[7-8]。龍膽是我國傳統(tǒng)的珍貴中藥材，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效，常用于濕熱蘊結(jié)于下焦之證[9]。龍膽苦苷（gentiopicroside，Gent）是龍膽的主要活性成分，同時也是存在于龍膽、秦艽等龍膽科植物中的環(huán)烯醚萜苷類化合物。現(xiàn)代藥理研究報道龍膽苦苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、降血糖等作用[10]。已有研究證明，龍膽苦苷可抑制肝臟中NLRP3炎性小體的表達，減少促炎因子的生成和釋放，下調(diào)炎癥水平。然而龍膽苦苷在腎臟是否同樣具有抑制炎癥反應從而保護腎臟的作用尚未有明確報道。基于此，本研究分析龍膽苦苷對小鼠高尿酸血癥的降尿酸作用和對腎臟NLRP3炎性小體信號通路的影響，進一步闡釋龍膽苦苷對高尿酸血癥小鼠的療效以及對腎臟炎癥的改善作用。

1 材料

1.1 動物

60只雄性昆明小鼠購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SYXK2020-0090。小鼠體質(zhì)量18～23 g，飼養(yǎng)溫度：23～25℃，濕度45%～55%，每日光照12 h，動物自由食用標準飼料和自由飲用蒸餾水。

1.2 試藥

龍膽苦苷（默克Sigma Aldrich公司，批號：20200703-2，純度≥ 98%）；羧甲基纖維素鈉（批號：20200128）、別嘌呤醇（ALL，批號：20200311）、氧嗪酸鉀（純度≥ 97%，批號：20200351）（美國Sigma公司）。URAT1抗體（貨號：AF14543）、有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白1（OAT1）抗體（貨號：AF27322）、OAT3抗體（貨號：AF13328）、NLRP3抗體（貨號：AF21232）、ASC抗 體（貨 號：AF33461）、Caspase-1抗體（貨號：AF22156）、山羊抗兔抗體（貨號：AF43326）、山羊抗大鼠抗體（貨號：AF48565）、猴抗小鼠抗體（貨號：AF42241）（Affinity公司）；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白9（GLUT9）抗體（貨號：AB14443）（Abcam公司）；IL-1β測定試劑盒（批號：20200522）、IL-18 測定試劑盒（批號：20200522）（江蘇酶免實業(yè)有限公司）；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（貨號：P0312）、蛋白酶抑制劑PMSF（批號：P0137）、RIPA裂解液（批號：P0112B）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0122S）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；SYBR實時熒光定量（qPCR）試劑盒（批號：P10525）、PrimeScript RT反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒（批號：C10112）、RNAiso plus總RNA提取試劑（批號：C26433）（日本TaKaRa公司）；4%多聚甲醛（批號：MA3302，美侖生物科技有限公司）；尿酸（UA，貨號：P29394）、肌酐（CRE，貨號：P30324）、黃嘌呤氧化酶（XOD，貨號：P26614）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 儀器

Elx808全波長多功能酶標儀（廣州吉源生物科技有限公司）；Nano Drop 2000c超微量分光光度計、CFX96實時定量PCR儀（美國賽默飛生物科技有限公司）；伯樂垂直電泳槽、伯樂電泳儀（美國Bio-rad生物科技有限公司）；Tanon4600天能曝光儀（中國天能生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 分組及干預方法

60只雄性昆明小鼠適應性飼養(yǎng)3 d后，按體質(zhì)量隨機分為對照組、模型組、陽性藥ALL組、龍膽苦苷低劑量組、龍膽苦苷中劑量組和龍膽苦苷高劑量組，每組10只。實驗期間，給予動物普通飼料和蒸餾水自由飲食。模型組、ALL組、龍膽苦苷低劑量組、龍膽苦苷中劑量組和龍膽苦苷高劑量組動物使用0.5%羧甲基纖維素鈉（0.2 mL/10 g）為溶劑，腹腔注射氧嗪酸鉀（300 mg·kg－1），連續(xù)注射15 d，構(gòu)建高尿酸血癥模型。對照組則腹腔注射等體積的蒸餾水。ALL組（5 mg·kg－1）、龍膽苦苷低劑量組（20 mg·kg－1）、龍膽苦苷中劑量組（40 mg·kg－1）和龍膽苦苷高劑量組（80 mg·kg－1）在腹腔注射氧嗪酸鉀1 h后，分別對小鼠灌胃相應劑量的藥物。對照組與模型組灌胃等體積的蒸餾水。

2.2 血清和臟器的收集

實驗結(jié)束后，對小鼠進行乙醚麻醉，眼眶取血。4℃、3500 g離心血液15 min得血清，－80℃保存?zhèn)溆谩ｋS后對小鼠脫頸椎法處死，剖取肝和腎，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 尿酸、肌酐和黃嘌呤氧化酶的檢測

分別剪取約0.5 g的肝組織加入到含有500 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS）的EP管中，勻漿，然后將所得勻漿液以3500 g離心10 min，取上清得肝上清液。采用BCA試劑盒檢測肝上清液的蛋白濃度。按照試劑盒操作說明測定動物血清中的尿酸和肌酐，以及血清和肝臟中黃嘌呤氧化酶的含量。

2.4 IL-1β和IL-18的檢測

分別剪取約0.5 g的腎組織加入到裝有500 μL PBS的EP管中，勻漿，然后將所得勻漿液以3500 g離心10 min，取上清得腎上清液。采用BCA試劑盒檢測腎上清液的蛋白濃度。按照試劑盒操作說明測定動物腎中IL-1β和IL-18，以及血清中IL-1β和IL-18的含量。

2.5 Western blot法檢測小鼠腎GLUT9、URAT1、OAT1、OAT3和NLRP3炎癥小體通路

將小鼠腎組織浸泡于RIPA裂解液中，冰上裂解30 min，勻漿，提取總蛋白。12 000 r·min－1離心15 min，取上清液。采用BCA試劑盒測定腎組織蛋白濃度。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2.5 h，加一抗（GLUT9、URAT1、OAT1、OAT3、NLRP3、ASC和Caspase-1）4℃冰箱孵育過夜；翌日加入相應二抗，孵育1 h，隨后顯色曝光，拍照并保存相應蛋白條帶，使用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，與內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度值校準。

2.6 qPCR測定iNOS和CD206的mRNA表達

按試劑盒說明書，提取腎上清總RNA并檢測RNA濃度，并保存于－80℃?zhèn)溆谩Ｊ褂梅崔D(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此cDNA為模板，用SYBR Green PCR Master Mix和相應的引物進行擴增。反應條件為：95℃預變性，持續(xù)30 s，95℃變 性，持 續(xù)5 s，60℃退 火30 s，72℃延伸60 s，進行40個循環(huán)。所得數(shù)據(jù)均采用2-ΔΔct進行相對定量分析。引物序列見表1。

表1 引物序列 Tab 1 Primer sequence

2.7 統(tǒng)計方法

所有實驗數(shù)據(jù)均采用±s的形式表達，應用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。組間差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊則采用LSD檢驗，方差不齊則采用Dunnett T檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 龍膽苦苷對高尿酸血癥小鼠血清尿酸和肌酐水平的影響

與正常組相比，模型組小鼠血清尿酸、肌酐水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，陽性藥ALL和各濃度的龍膽苦苷均能明顯下調(diào)血清中尿酸、肌酐的含量（P＜0.01），且具有劑量依賴性。說明龍膽苦苷對氧嗪酸鉀誘導的高尿酸血癥具有明顯的改善作用。

圖1 各組小鼠血清尿酸（A）和肌酐（B）的含量Fig 1 Content of UA（A）and CRE（B）in each group

3.2 龍膽苦苷對高尿酸血癥小鼠黃嘌呤氧化酶水平的影響

與正常組相比，模型組小鼠的血清和肝臟中的黃嘌呤氧化酶水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，ALL陽性藥能顯著下調(diào)黃嘌呤氧化酶水平（P＜0.01），同時龍膽苦苷各濃度也能下調(diào)血清和肝臟中的黃嘌呤氧化酶水平（P＜0.05，P＜0.01），且作用具有劑量依賴性（見圖2）。

圖2 各組小鼠血清（A）和肝臟（B）中黃嘌呤氧化酶的含量Fig 2 Content of XOD in serum（A）and liver（B）of each group

3.3 龍膽苦苷對高尿酸血癥小鼠尿酸轉(zhuǎn)運體蛋白水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠的GLUT9和URAT1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），OAT1和OAT3表達水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組相比，龍膽苦苷各劑量和陽性藥ALL能明顯降低GLUT9和URAT1蛋白表達水平（P＜0.01），升高OAT1和OAT3蛋白的表達（P＜0.05，P＜0.01），且龍膽苦苷降低各蛋白表達的作用具有劑量依賴性（見圖3）。

圖3 各組小鼠尿酸轉(zhuǎn)運蛋白的相對表達量Fig 3 Relative expression of uric acid transporter-associated proteins in each group

3.4 龍膽苦苷對高尿酸血癥小鼠尿酸轉(zhuǎn)運體mRNA表達水平的影響

與正常組相比，模型組小鼠的GLUT9和URAT1 RNA表達水平顯著升高（P＜0.01），OAT1和OAT3表達明顯降低（P＜0.01）。與模型組相比，陽性藥ALL和龍膽苦苷各個劑量均能升高小鼠的OAT1和OAT3表達（P＜0.01），且降低GLUT9和URAT1的表達（P＜0.01）（見圖4）。

圖4 各組小鼠尿酸轉(zhuǎn)運蛋白mRNA的相對表達量Fig 4 Relative mRNA expression of uric acid transporter-associated proteins in each group

3.5 龍膽苦苷對高尿酸血癥小鼠血清和腎臟炎性因子的影響

與正常組相比，模型組小鼠血清中和腎臟中的IL-1β和IL-18的含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，龍膽苦苷各劑量以及陽性藥ALL均能顯著降低血清以及腎臟中IL-1β和IL-18的含量（P＜0.01）（見圖5）。

圖5 各組小鼠血清和腎臟IL-1β和IL-18的含量Fig 5 Content of IL-1β and IL-18 in serum and liver of each group

3.6 龍膽苦苷對高尿酸血癥小鼠NLRP3炎性小體通路表達水平的影響

與正常組相比，模型組小鼠腎臟的NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，龍膽苦苷各劑量組和ALL組小鼠腎臟中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達則明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）（見圖6）。結(jié)果表明龍膽苦苷能夠抑制NLRP3炎癥小體信號通路的表達。

圖6 各組小鼠NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的相對表達量Fig 6 Relative expression of NLRP3，ASC and Caspase-1 in each group

3.7 龍膽苦苷對高尿酸血癥小鼠NLRP3炎性小體mRNA水平的影響

與正常組相比，模型組小鼠腎臟中NLRP3、ASC和Caspase-1的mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，龍膽苦苷各劑量和陽性藥ALL能夠顯著降低腎臟中NLRP3、ASC和Caspase-1的mRNA表達（P＜0.01）（見圖7）。結(jié)果表明龍膽苦苷能夠抑制NLRP3炎癥小體信號通路的表達。

圖7 各組小鼠NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA的相對表達量Fig 7 Relative mRNA expression of NLRP3，ASC and Caspase-1 in each group

4 討論

流行病學研究表明，高尿酸血癥的發(fā)病率逐年升高，且發(fā)病呈年輕化趨勢，防控形勢不容樂觀[11]。已有研究報道高尿酸血癥與尿酸生成過多和尿酸排泄減少密切相關[12-13]。臨床上對抗高尿酸血癥最廣泛的藥物為黃嘌呤氧化酶抑制劑，盡管其療效顯著，但藥物所伴隨的超敏綜合征可影響患者康復進程[6，14]。中醫(yī)認為，高尿酸血癥屬于“通風”“歷節(jié)”和“虎咬風”等范疇，其病機在于臟腑虧虛、濕痰瘀阻和濕熱蘊結(jié)[15-17]。龍膽具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效，尤善清下焦?jié)駸幔徽J為是治療高尿酸血癥的潛在藥物[9，18]。本研究結(jié)果表明龍膽苦苷可調(diào)控尿酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達，影響尿酸的排泄和重吸收，降低體內(nèi)尿酸含量改善高尿酸血癥，并抑制NLRP3炎性小體信號通路的表達，降低腎臟炎癥水平，發(fā)揮改善小鼠高尿酸血癥和腎臟炎癥的作用。

目前，已經(jīng)有許多小鼠模型用于研究高尿酸血癥的分子機制。這些模型主要通過4種不同的方式提高體內(nèi)尿酸的水平[19-21]：① 直接補充尿酸、尿酸前體或者高嘌呤食物，如黃嘌呤、次黃嘌呤、果糖或酵母；② 抑制尿酸排泄，可通過補充乙胺丁醇或者煙酸，抑制機體對尿酸的排泄能力；③ 抑制尿酸酶的活性，如氧嗪酸鉀，可抑制尿酸酶的活性降低尿酸的分解，造成尿酸在體內(nèi)的過度積蓄；④ 轉(zhuǎn)基因模型，如通過對尿酸轉(zhuǎn)運蛋白OAT1進行敲除，促使尿酸排泄受限制。其中，對動物進行氧嗪酸鉀飼養(yǎng)、灌胃以及腹腔注射是目前使用最廣泛的高尿酸血癥造模方法[22]。區(qū)別于飼養(yǎng)法和灌胃法，腹腔注射氧嗪酸鉀的操作既不影響動物的后期進食，也更能保證藥物的攝入量[23]，故本研究采用對動物腹腔注射氧嗪酸鉀的方法，并成功構(gòu)建高尿酸血癥模型。

尿酸轉(zhuǎn)運蛋白主要分為兩類：尿酸分泌蛋白和尿酸重吸收蛋白。作為尿酸分泌蛋白的主要成員之一，有機陰離子轉(zhuǎn)運體家族有十余種亞型[24]。其中，OAT1和OAT3是參與尿酸分泌的關鍵蛋白，分布于近端小管上皮細胞的基底外側(cè)。OAT1和OAT3攝取血液中尿酸的機制相似，二者均充當有機陰離子/酮戊二酸鹽交換體的角色，將α-酮戊二酸排出的同時完成對尿酸的攝取，降低血液中尿酸的含量[25-26]。另一方面，尿酸重吸收蛋白包括URAT1和GLUT9。URAT1分布于近端小管的上皮細胞管腔側(cè)或基底膜外側(cè)。根據(jù)近端小管管腔兩側(cè)的濃度梯度和電化學變化，URAT1介導管腔內(nèi)的尿酸與近端小管上皮細胞無機陰離子及有機陰離子的交換，進而促使尿酸轉(zhuǎn)運至上皮細胞內(nèi)。細胞內(nèi)的尿酸經(jīng)過位于近端小管上皮細胞基底外側(cè)和頂端的GLUT9轉(zhuǎn)移到腎間質(zhì)，完成從尿液重吸收尿酸到血液的過程[27]。本次研究結(jié)果顯示，各劑量的龍膽苦苷可明顯上調(diào)高尿酸血癥小鼠腎臟OAT1和OAT3的表達，同時顯著抑制高尿酸血癥小鼠腎臟GLUT9和URAT1的表達，減少近端小管上皮細胞對尿酸重吸收，并且增加尿酸的排泄，達到改善高尿酸血癥的作用。

腎臟炎癥是高尿酸血癥的典型病理特征，在高尿酸血癥的進展中起著關鍵作用。尿酸的過度積蓄會表現(xiàn)出細胞毒性作用[28-29]，其中的病理作用則包括誘導腎間質(zhì)炎性浸潤。尿酸的促炎作用主要體現(xiàn)在尿酸鹽結(jié)晶和可溶性尿酸，通過激活核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域3蛋白（NLRP3）炎性小體和腎小管上皮細胞NF-κB信號通路促進炎性細胞分泌促炎因子，上調(diào)腎臟的炎癥水平，造成腎臟的炎性浸潤[30-31]。尿酸及尿酸鹽結(jié)晶激活NLRP3炎性小體[32]，NLRP3炎性小體通過模式識別受體3與凋亡相關點樣蛋白（ASC）和胱天蛋白酶1的前體（Pro-caspase1）寡聚而成[33]。在正常的生理情況下，Pro-caspase1處于無活性狀態(tài)。當NLRP3炎性小體激活，對Pro-caspase1進行加工并將其活化為具有活性的Caspase-1，進而對白細胞介素-1β（IL-1β）前體和白細胞介素-18（IL-18）前體進行剪切，生成和釋放IL-1β和IL-18，參與多種炎癥性疾病的發(fā)病進程[34-35]。在本研究中，高尿酸血癥小鼠腎臟中IL-1β和IL-18含量上升，說明NLRP3炎性小體被激活，產(chǎn)生炎性因子增加對腎臟的炎性損傷。經(jīng)龍膽苦苷干預后的高尿酸血癥小鼠腎臟中IL-1β和IL-18含量下調(diào)，提示NLRP3炎性小體激活受抑制，降低腎臟炎癥水平，改善腎損傷。

綜上所述，龍膽苦苷可通過調(diào)控小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達，降低小鼠體內(nèi)尿酸含量，發(fā)揮治療高尿酸血癥小鼠的作用，并且抑制尿酸過度積蓄誘導的腎臟NLRP3炎性小體的激活，降低腎臟炎癥反應水平，緩解腎臟炎癥。