鹽酸曲美他嗪納米乳的制備及其對缺血缺氧型 心肌細胞的保護作用

刁中極，平洋，雷銳，虞德忱，殷實，王偉（.佳木斯市中心醫院，黑龍江 佳木斯 5400；.佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 54007）

缺血性心血管疾病是臨床常見病和多發病，大量的循證醫學數據表明，心血管疾病的治療藥物主要是通過改善局部缺血心肌的氧供需平衡，間接發揮心肌保護作用，但治療后仍有患者留有心力衰竭的癥狀或體征[1]。因此合理優化心肌能量代謝受到了廣大醫務工作者的推薦。曲美他嗪作為一種改善能量代謝的新藥，因其獨特的作用機制及效果，在臨床中越來越受到重視。由于其能減輕心肌細胞酸中毒和細胞內Na＋、Ca2＋超載，抑制氧自由基生成，穩定線粒體膜功能狀態[2]，其臨床應用已從單純穩定型心絞痛擴展到對多種心肌缺血及心功能障礙的保護治療。鹽酸曲美他嗪在臨床上的使用劑型為口服普通片劑、緩釋片劑和膠囊劑[3-4]，以固體制劑形式的給藥方式，難免會影響藥物的體內吸收，本研究通過藥劑學方法和手段，將鹽酸曲美他嗪制備成W/O型口服納米乳劑。納米乳具有較小粒徑，分散均勻度高，藥物分散度高，能提高藥物作用效果，同時對藥物透皮吸收也有促進作用。鹽酸曲美他嗪納米乳劑的研究將為曲美他嗪新劑型開發提供研究基礎。

1 儀器及試藥

FA2004N電子分析天平（上海恒平科學儀器）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器）；JY92-2D超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物儀器）；MALVERN Zetasizer Nano ZS粒徑分析儀（英國馬爾文儀器）；透射電子顯微鏡（日本株式會社儀器）；Agilent高效液相色譜儀工作站（日本島津儀器）；371型-CO2培養箱（美國Thermo儀器）；TECAN sunrise光吸收酶標儀（瑞士帝肯儀器）；TGL-16GB臺式高速離心機（上海安亭科學儀器）；KQ-200KDB型高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器）；SZ93-1自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器）；Innoval ODS-2 C18色譜柱（博納艾杰爾儀器）。

鹽酸曲美他嗪（批號：Lot#E1905020，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；1，2-丙二醇（天津市大茂化學試劑廠）；脂肪酸山梨坦80（Span-80）、聚乙二醇400（PEG-400）（上海山浦化工有限公司）；聚氧乙烯40氫化蓖麻油（RH 40）、大豆磷脂（PC）、肉豆蔻酸異丙酯（IPM）、辛葵酸甘油酯（GTCC）、聚山梨酯-80（Tween-80）、液體石蠟、1-庚烷磺酸鈉（上海麥克林生化科技有限公司）；大豆油（九三糧油工業集團有限公司）；單硬脂酸甘油酯（江蘇伯業生物科技有限公司）；無水乙醇（天津市凱通化學試劑有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；H9c2 大鼠心肌細胞（中國科學院上海細胞庫）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學研究所）；DMEM 高糖培養基、胎牛血清、0.25%胰酶、PBS（Hyclone）；肌酸激酶同工酶（CKMB）試劑盒（上海酶聯生物技術有限公司，批號：20191013）、超氧化物歧化酶（SOD、批號：20191103）和丙二醛（MDA、批號：20191104）試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 處方中各組分篩選

2.1.1 乳化劑的篩選 擬對PC、Span-80、RH 40、單硬脂酸甘油酯作為乳化劑篩選，基于文獻方法[5]，采用丙二醇為助乳化劑，IPM為油相，乳化劑∶助乳化劑∶油相按1∶1∶2（質量比）稱取并混合，置于恒溫磁力攪拌器中，待形成透明溶液時緩慢滴加蒸餾水進行乳化。以乳劑外觀狀態為指標，進行乳化劑篩選。

2.1.2 助乳化劑的篩選 擬對PEG-400、Tween-80、無水乙醇與丙二醇作為助乳化劑篩選。分別按1∶1的比例與PC混合，將混合溶液按1∶1的比例與IPM混合，制備方法同上。以乳劑外觀狀態進行助乳化劑篩選。

2.1.3 油相的篩選 擬對IPM、GTCC、液體石蠟以及大豆油作為油相篩選，助乳化劑丙二醇和無水乙醇分別與乳化劑PC按1∶1的比例進行混合，再將混合溶液按1∶1的比例依次與上述的油相混合。以乳劑外觀狀態及過微孔濾膜阻力大小為指標，對油相進行篩選。

2.1.4 乳化劑與助乳化劑質量比的篩選 乳化劑與助乳化劑的質量比（Km）可以反映二者配比關系對納米乳形成的影響。固定PC/丙二醇/IPM/水納米乳體系[6]，將PC與丙二醇以Km為1∶1、1∶2、2∶1、3∶1、3∶2與4∶1進行混合，恒溫磁力攪拌一段時間，使成透明溶液后，緩慢滴加蒸餾水，形成空白納米乳。以乳劑外觀狀態及過膜阻力為指標確定PC與丙二醇的Km。

2.1.5 偽三元相圖確定乳化區域 將PC與丙二醇以固定比例Km3∶2置于燒杯中，再將混合溶液與油相按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1混合均勻，于52℃恒溫磁力攪拌至全溶，向溶液體系中滴加蒸餾水，待體系由澄清變渾濁時記錄雙蒸水用量[7-9]，采用origin 9.0軟件繪制偽三元相圖。

2.1.6 復合乳劑的篩選 為得到預期粒徑的納米乳溶液，擬采用復合乳化劑[10-13]，即調整混合乳化劑的親水親油平衡值（HLB），增加乳化膜的穩固性。以Tween-80和PC作為復合乳化劑，基于處方（用量比）PC∶丙二醇∶IPM∶鹽酸曲美他嗪水溶液＝5∶3.43∶33.83∶9。將PC與Tween-80以5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1混合制備納米乳，以乳劑形成狀態、形成納米乳時的溫度區間、超聲分散后乳劑的外觀、過微孔濾膜阻力以及粒徑為考察指標，對復合乳化劑進行篩選。

2.2 鹽酸曲美他嗪納米乳的制備

精密稱取PC 1.20 g、Tween-80 0.3 g、丙二醇1.03 g、IPM 10.15 g置于燒杯中，于52℃下恒溫磁力攪拌至PC全溶，再稱取鹽酸曲美他嗪原料藥100 mg于2.6 g雙蒸水中，攪拌使其溶解，于室溫下緩慢地向上述混合體系中滴加鹽酸曲美他嗪溶液直至體系變為透明狀均勻液體，將溶液置于冰水浴條件下，功率為70%，超聲分散7 min，即得鹽酸曲美他嗪納米乳。

2.3 鹽酸曲美他嗪納米乳的表征

2.3.1 丁達爾現象 按“2.2”項下方法制備納米乳，采用外激光照射方式，觀察鹽酸曲美他嗪納米乳。

2.3.2 納米乳劑類型鑒別 分別取兩份鹽酸曲美他嗪納米乳1.5 mL置于離心管中，向兩離心管中分別滴加蘇丹紅Ⅲ和亞甲基藍染色劑，靜止放置，觀察兩種染色劑在乳液中的擴散程度，以確定納米乳劑類型[14]。

2.3.3 納米乳外觀形態觀察 取鹽酸曲美他嗪納米乳1 mL，加入IPM溶液按體積比1∶10進行稀釋，待測樣品滴于超薄碳膜上，待自然揮干后，于透射電子顯微鏡（TEM）下觀察外觀形態。

2.3.4 粒徑及zeta電位 取鹽酸曲美他嗪納米乳，分別置于石英比色皿和電位檢測池中，采用馬爾文激光粒度儀測定納米乳的粒徑與zeta電位。

2.4 鹽酸曲美他嗪納米乳的檢測

2.4.1 色譜條件 流動相：1-庚烷磺酸鈉溶液（1-庚烷磺酸鈉1.8383 g，純凈水配制，磷酸調節pH 2.55）-乙腈-甲醇＝645∶316∶39；色譜柱：Innoval ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1 mL·min－1；紫外檢測波長：231 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸曲美他嗪對照品500 mg，甲醇溶解并定容于100 mL 量瓶中，即得質量濃度為5.0 mg·mL－1的鹽酸曲美他嗪對照品溶液，備用。

2.4.3 空白納米乳樣品的制備和測定 精密吸取空白納米乳1 mL，加入10 mL甲醇溶液破乳，于8000 r·min－1離心15 min，取1 mL上清液于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，即得空白納米乳樣品；待測樣品過0.22 μm濾膜，進樣檢測。

2.4.4 含量測定 精密量取鹽酸曲美他嗪納米乳1 mL，按“2.4.3”項下方法處理，即得鹽酸曲美他嗪納米乳待測樣品，過0.22 μm濾膜，進樣檢測。

2.5 H9c2 心肌細胞保護作用

2.5.1 H9c2心肌細胞培養及分組 大鼠 H9c2 心肌細胞于 DMEM 高糖培養基（含10% FBS、1%雙抗）中，37℃、5% CO2恒溫培養箱中靜置培養。正常組用完全培養基于培養箱中繼續培養；模型組用完全培養基培養1 h 后更換為無糖無血清的DMEM 培養基，密閉培養。給藥組以含藥培養基培養，1 h 后更換為無糖無血清的DMEM 培養基，密閉培養。

2.5.2 CCK-8法檢測 H9c2 心肌細胞存活率 取對數生長期H9c2 心肌細胞按1×105個·mL－1，接種于96孔板內，每個濃度設定3個復孔，于5%CO2培養箱中正常培養，每孔加入不同濃度的納米乳溶液，對照組加等量培養液，繼續培養12、24、48 h后每孔加入 CCK-8 溶液于5%CO2培養箱培養，酶標儀450 nm測定各孔的吸光度值，并計算各組對H9c2細胞的生長抑制率。

2.5.3 比色法檢測LDH含量及心肌細胞內 CKMB、SOD、MDA 含量 取出上述細胞培養液，按照試劑盒說明書檢測細胞培養液中的 LDH 含量及細胞內 CK-MB、SOD、MDA的含量[15-16]。

2.6 數據處理

采用SPSS 13.0軟件進行統計，數據以（±s）表示，進行正態分布、方差齊性檢驗，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 處方各組分篩選結果

3.1.1 乳化劑的篩選結果 結果見表1所示，由乳劑外觀結果最終確定乳化劑為PC。

表1 乳化劑篩選結果 Tab 1 Screening of emulsifiers

3.1.2 助乳化劑的篩選結果 結果如表2所示，由乳劑外觀可知，無水乙醇和丙二醇均能得到外觀澄清透明的納米乳溶液，故進一步進行篩選。

表2 助乳化劑的篩選結果 Tab 2 Screening of co-emulsifier

3.1.3 油相的篩選結果 結果如表3所示，通過對油相的篩選，確定了助乳化劑為丙二醇，而油相篩選結果中IPM和GTCC均能得到較理想的乳劑，由于GTCC價格較貴，最終確定IPM為油相。

表3 油相篩選的結果 Tab 3 Screening of the oil phase

3.1.4 乳化劑與助乳化劑質量比的篩選結果 由表4可知，乳化劑與助乳化劑的Km比為3∶2時，能夠滿足各項篩選結果。

表4 Km的篩選結果 Tab 4 Screening of the Km

3.1.5 偽三元相圖確定乳化區域 如表5所示，當混合溶液體系由澄清變混濁時納米乳中各部分所占質量百分比，通過繪制偽三元相圖初步確定鹽酸曲美他嗪納米乳的乳化區域（見圖1），用于進一步優化鹽酸曲美他嗪納米乳中各相處方所占比例見表6。

圖1 PC/Propylene glycol/IPM/雙蒸水體系偽三元相圖Fig 1 Pseudo ternary phase diagram of PC/Propylene glycol/IPM/double distilled water system

表5 乳化區域 Tab 5 Emulsification area

各組中NE1組與其余3組相比，水相含量高，納米乳粒徑值較小，PDI值最小，表明該處方液滴的分散性較好，流動性好。因此鹽酸曲美他嗪納米乳處方為乳化劑-助乳化劑∶油相∶水相＝5∶20∶4， 其中乳化劑∶助乳化劑為3∶2，見表6。

表6 納米乳的組成、粒徑及分散性 Tab 6 Composition，particle size and dispersibility of nanoemulsion

3.1.6 復合乳化劑的篩選結果 復合乳化劑篩選結果見表7，PC∶Tween-80＝4∶1時，制備的納米乳粒徑值較為理想，且該處方在后續冷藏（4℃）的條件下，乳液未出現油水分層，沉淀析出，因此確定鹽酸曲美他嗪納米乳的最終處方W%為復合乳化劑-助乳化劑：油相∶水相＝5∶20∶4，其中復合乳化劑∶助乳化劑＝3∶2，復合乳化劑為PC∶Tween 80＝4∶1。

表7 復合乳化劑的篩選結果 Tab 7 Screening of compound emulsifier

3.2 鹽酸曲美他嗪納米乳的表征

3.2.1 丁達爾現象 制備的納米乳，外觀為金黃色澄清透明的均一液體，用激光光束照射納米乳時，出現一束明顯的紅色光柱，即產生丁達爾效應，證明制備的納米乳屬于膠體溶液，結果見圖2。

圖2 鹽酸曲美他嗪納米乳的丁達爾效應Fig 2 Tyndall effect of trimetazidine hydrochloride nanoemulsion

3.2.2 納米乳類型鑒別結果 由圖3可見油溶性染色劑擴散程度要比水溶性染色劑擴散速度快，且分布均勻，故可判斷制備的鹽酸曲美他嗪納米乳為W/O型[14]。

圖3 納米乳的類型鑒別Fig 3 Types of nanoemulsion

3.2.3 納米乳外觀形態觀察結果 如圖4所示，在TEM中可觀察到鹽酸曲美他嗪納米乳的外觀形態為均一大小、分布均勻的類圓形乳滴粒子。

圖4 鹽酸曲美他嗪納米乳TEM圖Fig 4 TEM image of trimetazidine hydrochloride nanoemulsion

3.2.4 粒徑及zeta電位 鹽酸曲美他嗪納米乳的粒徑值為（161.97±1.20）nm，PDI為0.224，zeta電位值為－0.328 mV，見圖5～6。

圖5 鹽酸曲美他嗪納米乳粒徑分布圖Fig 5 Distribution of trimetazidine hydrochloride nanoemulsion particle sizes

圖6 鹽酸曲美他嗪納米乳zeta 電位圖Fig 6 Zeta potential of trimetazidine hydrochloride nanoemulsion

3.2.5 專屬性考察 由圖7可知，供試品溶液的藥物的保留時間與對照品一致tR＝8.103 min，而且空白樣品對鹽酸曲美他嗪的測定無干擾，分析方法的專屬性良好。

圖7 HPLC 色譜圖Fig 7 HPLC chromatogram

3.2.6 鹽酸曲美他嗪納米乳含量測定 測得納米乳中鹽酸曲美他嗪的含量為4.17 mg·mL－1。

3.3 缺血缺氧型心肌細胞的保護作用研究

3.3.1 CCK-8法檢測H9c2細胞存活率 結果如表8所示，模型組與正常組比較差異有統計學意義（P＜0.01），說明缺血缺氧型心肌細胞模型建立成功；各濃度治療組與模型組比較H9c2細胞存活率明顯升高（P＜0.01），并表現出濃度依賴性。

表8 H9c2細胞存活率(±s，n＝3) Tab 8 Survival rate of H9c2 cells (±s，n＝3)

表8 H9c2細胞存活率(±s，n＝3) Tab 8 Survival rate of H9c2 cells (±s，n＝3)

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，# P＜0.01。Note：Compare with the normal group，*P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.01.

組別 劑量/（mg·mL－1） OD值 存活率/%正常組 － 0.2013±0.0020 100.00模型組 － 0.1104±0.0035* 43.96治療組1 0.0045 0.1387±0.0027*# 61.41治療組2 0.045 0.1428±0.0012*# 63.93治療組3 0.45 0.1691±0.0021*# 80.15

3.3.2 LDH、CK-MB、SOD及MDA含量 結果如表9所示，與正常組比較，模型組H9c2細胞培養液中LDH含量顯著增高（P＜0.01）；CKMB、MDA含量顯著升高，SOD含量顯著降低（P＜0.01）與模型組比較，各治療組H9c2細胞培養液中LDH含量明顯降低（P＜0.01）。各治療組CK-MB、MDA含量均有不同程度降低（P＜0.01），SOD含量升高（P＜0.01）。

表9 H9c2 心肌細胞培養液中 LDH及細胞內相關生化指標含量(x±s，n＝3) Tab 9 Content of LDH and related biochemical indexes in H9c2 cells (x±s，n＝3)

4 討論

缺血性心血管疾病可引起心肌缺氧，心肌細胞能量代謝紊亂。鹽酸曲美他嗪通過調節心肌代謝底物，改善能量代謝及心肌缺血，加強心臟功能。現代藥理學研究表明，CK-MB 為主要存在于心肌中的肌酸激酶同工酶，當心肌發生急性損傷時會大量釋放，具有較高的特異性，可以作為判斷心肌損傷程度的依據[17-18]。SOD和MDA均與氧化應激密切相關，兩者可通過減少脂質過氧化物產生、增加抗氧化物酶的活性而減少氧化應激，抑制細胞凋亡，進而提高細胞存活率，保護心肌細胞[19]。本研究制備的鹽酸曲美他嗪納米乳劑制備方法簡單易于操作，對H9c2 心肌細胞有一定的保護作用，且制備的納米乳劑為W/O型，可增加藥物的脂溶性，進一步改善藥物的體內跨膜轉運效率，為其體內藥動學和藥理學研究提供研究基礎。