LC-MS/MS法測定人血漿中利奈唑胺濃度的不確定度評定

劉艷芳，張琛琛，蔡朝紅*，黨大勝（.北部戰區總醫院臨床試驗研究室，沈陽 0840；.沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院，沈陽 0840；3.北部戰區總醫院臨床藥學室，沈陽 0840）

利奈唑胺（linezolid）是第一個應用于臨床的唑烷酮類全合成抗菌藥，臨床主要用于治療耐萬古霉素屎腸球菌引起的感染、耐甲氧西林金黃葡萄球菌引起的院內獲得性肺炎等[1]。由于利奈唑胺獨特的作用機制與現有抗菌藥無交叉耐藥，被認為是治療多重耐藥革蘭氏陽性菌感染的最后防線[2]。隨著利奈唑胺應用的增多，一些較為嚴重的不良反應逐漸暴露出來[3-4]，臨床對其在中國人體藥動學研究以及特殊人群實時的血藥濃度監測的需求越來越高，基于此本研究室建立了高效液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法測定人血漿中利奈唑胺濃度，同時為了控制檢測質量，達到檢測數據國際互認的要求對方法進行不確定度評價。

1 材料

UFLC-20AD超高速液相色譜系統（日本島津公司），3200Q-Trap質譜儀（美國AB Sciex公司），Mettler MS 105分析天平（Mettler），Eppendorf 5804R低溫冷凍離心機（Eppendorf），IKA VORTEX GENIUS 3 mm-1型振蕩器（IKA VORTEX）。利奈唑胺（批號：130640-201901，純度：99.6%，規格：100 mg/支），卡馬西平（批號：100142-201706，純度：100.0%，規格：100 mg/支）（中國食品藥品檢定研究院），甲醇（批號：1099307025，色譜純，德國MERCK公司），超純水由Milli Q 型純水儀制得（Millipore，USA）。

2 方法

2.1 分析條件[5-6]

色譜柱：Waters Xterra MS C18（3.5 μm，100 mm×2.1 mm），流動相：A為純水，B為甲醇，梯度洗脫：0～2.0 min，5%～95%B；2.0～3.0 min，95%B；3.0～3.1 min，95%～5%B；3.1～5.0 min，5%B。流速：0.35 mL·min－1，柱溫：40℃，進樣量：0.5 μL。電噴霧離子源；正離子模式；多反應離子監測方式；噴射電壓：4500 eV；源溫度：550℃；離子源氣體：50 psi；輔助氣：25 psi；氣簾氣：35 psi；碰撞氣：medium；掃描時間：150 ms；定量分析離子對：338.2～296.1（利奈唑胺），237.0～194.0（卡馬西平）。

2.2 溶液配制

2.2.1 系列對照品溶液 精密稱取利奈唑胺對照品22.13 mg置10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，得2.20 mg·mL－1儲備液。精密移取上述儲備液適量用甲醇逐級稀釋，即得2.00、5.00、20.0、50.0、100、200、400 μg·mL－1的系列對照品溶液以及質量濃度為4.00、40.0及320 μg·mL－1的低（QCL）、中（QCM）、高（QCH）質控溶液。

2.2.2 內標溶液配制 精密稱取卡馬西平10.79 mg置10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，得1.08 mg·mL－1內標儲備液。精密移取23.2 mL上述內標儲備液置10 mL量瓶，甲醇定容得質量濃度為2.50 μg·mL－1的內標溶液。

2.3 校正標樣/質控樣品的制備

取對照品溶液/質控溶液10 mL置1.5 mL離心管中，分別加入90 mL人空白血漿、10 mL內標溶液、700 mL甲醇，渦旋混合1 min，4℃離心10 min（1610×g），取上清液50 mL，加甲醇150 mL渦旋混合1 min，即得。

2.4 數學模型的建立

yi＝axi＋b，其中yi為待測物響應信號與內標響應信號之比，a為標準曲線斜率；b為標準曲線截距；xi為待測物濃度與內標濃度之比。

3 結果

3.1 不確定度來源

樣品測定的每一個步驟都有可能引入不確定度，本實驗測量不確定度來源主要包括操作重復性、稱量、溶液配制、提取回收、基質效應、儀器量化、標準曲線擬合等。

3.2 不確定度評定

3.2.1 重復性引入的不確定度Ur（1） 取質控樣品QCL、QCM、QCH各6份，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，計算質控樣品濃度，重復進行3組，結果見表1。

表1 利奈唑胺重復測定數據 Tab 1 Repeated measurement of linezolid concentration

依據貝賽爾公式計算利奈唑胺合并樣本偏差：

公式中k為每組平行測定次數（1，2，...，n），j為組數（1，2，…，m），G為組別（L、M、H）。

經計算：S（X，L）＝0.023 μg·mL－1，S（X，M）＝0.156 μg·mL－1，S（X，H）＝1.614 μg·mL－1

以每組平均值表示測量結果，平均值的標準偏差公式為：

經計算：

測量結果的相對標準不確定度為：

經計算：Ur（1，L）＝0.0136，Ur（1，M）＝0.0088，Ur（1，H）＝0.0117。

3.2.2 稱量引入的不確定度，Ur（2） 稱量過程，天平靈敏度帶來的不確定度可忽略不計，依據計量檢定證書，所用電子天平e＝0.01 mg。按矩形分布考慮，包含因子k＝，隨機變量半寬a＝0.5e，天平的非線性誤差為：

天平自動調零引起的誤差，其 a0＝a，則天平自動調零引起的誤差為：

不考慮重復性誤差時，天平的標準不確定度為：

利奈唑胺的稱量相對標準不確定度為：

3.2.3 溶液配制引入的不確定度，Ur（3）

（1）對照品純度引入的不確定度，此項屬B類不確定度，按矩形分布處理，其相對標準不確定度如下：

（2）標準溶液及質控溶液配制過程引入的不確定度：配制溶液用到的移液槍為Thermo Finnpipette F3移液槍，型號為 2～20 μL（P1）、10～100 μL（P2）、20～200 μL（P3）和 100～1000 μL（P4），其容量的最大允差分別為±0.2 μL、±0.8 μL、±1.6 μL和±8 μL，10 mL量瓶（V1）最大允差為±0.020 mL。Ur（P1）＝a/（） ＝0.0058，Ur（P2）＝Ur（P3）＝Ur（P4）＝0.0046，Ur（V）＝0.000 57。

利奈唑胺系列標準溶液配制過程共使用10 mL量瓶（V1）1次，移液槍2～20 μL（P1）3次，10～100 μL（P2）1次，20～200 μL（P3）1次，

則利奈唑胺溶液配制整個過程引入的相對標準不確定度為：

3.2.4 校正標樣和質控樣品制備引入的不確定度，Ur（4） 校正標樣（S）和質控樣品（G）均按照“2.3”項下方法制備，使用移液器及次數為：2～20 μL移液器2次，10～100 μL移液器2次，20～200 μL移液器1次，100～1000 μL移液器1次。標準曲線共6個點，則樣品相對標準不確定度為：

3.2.5 樣品提取過程引入的不確定度，Ur（5） 按“2.2.1”項下方法制備低、中、高濃度質控樣品，每濃度6份并進樣分析，得到與內標的峰面積比值為C；取18份空白血漿，加入700 μL甲醇，混勻，4℃離心10 min（1610×g），取上清液并加入標準溶液和內標溶液使其濃度與質控樣品濃度相同，渦旋混合1 min后取上清液50 mL，加甲醇150 mL，渦旋混合1 min后取0.5 mL進樣分析。每濃度6樣本分析，獲得相應峰面積為B，則利奈唑胺在血漿樣本中的提取回收率＝C/B×100%，低、中、高濃度質控樣品回收率分別為（94.4±9.36）%、（98.1±1.87）% 和（102.5±4.12）%。回收率的相對標準不確定度計算公式為：

則，利奈唑胺低、中、高濃度質控樣品回收率的相對標準不確定度分別為：

3.2.6 基質效應引入的不確定度，Ur（6） 取處理后基質及空白溶劑配制低、高濃度質控樣品，每濃度平行測定6次，內標歸一化基質效應＝處理后基質配制樣品的峰面積與內標峰面積比值（A）/空白溶劑配制樣品的峰面積與內標峰面積比值（B），計算得低、高濃度質控樣品的基質效應分別為（117.1±4.64）% 和（115.5±5.75）%，基質效應引入的相對標準測量不確定度計算公式為：則利奈唑胺低、高濃度質控樣品的相對標準不確定度為：

3.2.7 儀器量化引入的不確定度，Ur（7） 所用液質聯用儀為AB3200 Q-Trap，其中質譜定量的最大允差為2%，液相色譜取樣的最大允差為1%，按矩形分布，儀器量化的相對標準不確定度為：

3.2.8 線性擬合引入的不確定度Ur（8） 本實驗標準曲線除零點外有6個濃度點，連續測定6次，每個樣品中利奈唑胺峰面積與內標峰面積的比值見表2，經擬合曲線回算校正標樣中利奈唑胺濃度結果見表3。

表2 利奈唑胺與內標峰面積比及回歸曲線參數 Tab 2 Peak area ratio of linezolid with the internal standard and parameters of the calibration curves

表3 經擬合曲線計算出的每個校正標樣中利奈唑胺的濃度 (μg·mL－1) Tab 3 Back-calculated concentration of linezolid in standard plasma samples (μg·mL－1)

用生物樣品峰面積比的平均值對濃度以加權最小二乘法進行線性回歸（權重1/x2）得回歸方程，斜率a＝0.1557，截距b＝6.203×10－3。每個濃度重復分析的次數為6次，m＝6；標準曲線有6個濃度，n＝6；N為測定標準血漿溶液的總次數，N＝m×n＝36，共測定36次；j為測定標準血漿的序數（j＝1，2，3…N）；為6個標準血漿濃度的理論平均值，＝11 μg·mL－1。

殘余標準偏差為：

用本方法測定低、中、高濃度質控樣品各18次（P＝18），得到平均濃度

其標準不確定度為：

按公式計算利奈唑胺低、中、高濃度質控樣品相對標準不確定度為：

則：Ur（8，L）＝0.0344；Ur（8，M）＝0.0031；Ur（8，H）＝0.0005。

3.2.9 其他因素引入的不確定度 本實驗操作中間步驟少，過程簡單，耗時短，且樣品制備室、進樣室等均有空調進行溫度控制，操作過程幾乎無溫度波動，故忽略溫度影響。樣品制備過程取液前均進行了充分震搖，有效避免取液的不均一性，因此本文忽略不均一性帶來的不確定度。

3.3 合成不確定度的評定

3.3.1 標準測量不確定度的合成 依據不確定度傳播律對各相對標準測量不確定度進行合成：

則利奈唑胺質控樣品的合成相對標準測量不確定度分別為：

利奈唑胺質控樣品測定的合成標準測量不確定度為：

則：U（L）＝0.0276；U（M）＝0.1753；U（H）＝1.6011。

3.3.2 標準測量不確定度的擴展 用簡易評定方法，取k＝2，此時對應的置信概率P＝95%，得到擴展不確定度為：UG＝k×U（G），則：UL＝0.055；UM＝0.351；UH＝3.20。

3.4 測定結果的表示

人血漿中利奈唑胺低、中、高濃度質控的測定結果在k＝2（P＝95%）時可以分別表示 為（0.395±0.055）μg·mL－1、（4.18±0.351）μg·mL－1和（32.5±3.20）μg·mL－1。

4 討論

本文依據JJFl059-1999《測量不確定度評定與表示》[7]，中國合格評定國家認可委頒布的CNAS-CL01-G003：2019《測量不確定度的要求》[8]和CNAS-GL006：2019《化學分析中不確定度的評估指南》[9]，參照已發表文章的方法[10-13]，按照實驗過程尋找不確定度的來源，各不確定度分量的統計直方圖見圖1，由圖可知低濃度質控樣品不確定度來源主要為提取回收、線性擬合和樣品制備，中濃度不確定度來源主要為樣品制備，高濃度不確定度來源主要為樣品制備、基質效應和溶液配制。

圖1 液質聯用法測定利奈唑胺不確定度分量統計直方圖Fig 1 Histogram of uncertainty components in linezolid determination by LC-MS/MS

本文采用甲醇沉淀蛋白法進行樣品提取，處理過程簡單，干擾物質少，且方法無殘留效應，對比中、高濃度質控樣品不確定度結果，低濃度不確定度高主要因為SD值較高，即操作不平行導致，增加操作培訓及考核可有效避免此類問題。線性擬合對低濃度樣品的不確定度貢獻較大，這與同類文獻[10]結論一致，本文在不改變線性范圍的情況下，對標準曲線的點數進行考察，分別用5、6、7個點作標準曲線，線性均合格的情況下，不確定度值大小順序為：5點標曲＞7點標曲＞6點標曲，因此本文采用6個點濃度做標準曲線，同時證明相同線性范圍情況下并非濃度點數越多越好，而要根據實際情況進行考察以減少線性擬合引入的不確定度。

樣品制備對低、中、高濃度質控樣品不確定度貢獻均較大，此項由校正樣品和質控樣品兩個分項共同構成，按照公式標準曲線點越少，樣品制備過程越簡單此項值越低，但標準曲線點個數設置會影響線性擬合值，要進行綜合評估來決定，可以通過優化操作過程減少此項值。

基質對高濃度質控不確定度影響較低濃度大，主要是操作平行性的影響，同時若能采用穩定同位素做內標，必要時改用其他離子源來降低基質效應從而減少不確定值。因2020年版《中國藥典》只要求對低、高濃度質控樣品進行基質效應考察，故本文未將中濃度納入基質效應的不確定度評價。溶液配制由對照品純度、對照品溶液配制及質控溶液配制三分項共同構成，可以通過提高對照品純度，減少溶液配制體積來控制不確定度結果。