基于生物打印3D細胞微流控芯片的常用中藥 注射液肝臟安全性再評價

朱麗穎，杜宏英，何宇涵，于明星，張丹丹，楊劍，賀爽，董鵬志，廖園洪，廖玲妮，張俊華，關一民，朱彥*（.天津中醫藥大學，組分中藥國家重點實驗室，天津 30093；.上海微技術工業研究院，上海 0800；3.天津國際生物醫藥聯合研究院，中藥新藥研發中心，天津 300457）

3D生物打印是一項新興技術，由于其可高度精確快速按照設定堆疊目標物，在再生醫學、診斷、人工組織和器官方面被寄予厚望，在構建人工組織和器官時通常把細胞和生物相容性的細胞培養膠作為生物墨水進行打印[1]。生物打印的原理大致基于光刻法、噴墨式、微擠壓、激光輔助打印4種[2-4]。3D生物打印的組織模型在中藥研究中的可期應用已有報道[5]。微流控芯片技術也已用于中藥抗腫瘤活性成分篩選[6]。

類器官微流控芯片是集生物學、微工程技術、材料學、藥學、醫學、力學、機械等為一體的多學科交叉技術，目前的微流控芯片共性主要是材料、區域劃分和制作方法，聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜經常被用于芯片制作，功能區劃分基本一致：進出口、流道、細胞培養區[7]，制作方法包括3D打印、光刻法等[8]。微流控技術與水凝膠應用結合可定制隨時間變化的生化微環境和氧氣濃度等因素[2，9]。基質膠和甲基丙烯酸酐化明膠（GelMA）經常被用于3D培養膠；多種細胞可用于類器官構建，如原代細胞、多能干細胞[包括胚胎干細胞和誘導多能干細胞（iPSCs），其中iPSCs尤為多用]、癌細胞系等[10]。已報道的類器官芯片多種多樣，包括肝臟、心臟、類血管、腎臟、血腦屏障、脾臟、肺、腸道及血管與各種類器官的組合、多器官組合研究。其中肝臟類器官芯片、心臟類器官芯片、小腸類器官芯片、類血管芯片研究最多。類器官微流控芯片模型用于藥物發現和篩選，器官的生長發育，病變的體外建模研究，再生醫學，藥物毒性研究等多個領域[11]。

微流控技術和細胞共培養可使模型更接近于實際器官，從而使實驗結果更準確，且更有利于機制研究。Wang等[12]通過軟光刻技術在PDMS上制作了毫米級可容納3D細胞的微流控芯片，注入iPSCs細胞增殖培養成微球，先分化成內胚體，再進一步誘導分化為肝類器官。在灌流培養條件下，顯示出細胞活力的提高和成熟肝基因[白蛋白（ALB）和細胞色素P4503A4酶（CYP3A4）]的高表達。Ortega-Prieto等[13]用原代肝細胞和非實質細胞構建了可培養至40 d的3D微流控系統，在該模型中再現了乙型肝炎病毒生命周期的所有步驟，原代肝細胞與其他非實質細胞的共培養能夠識別免疫效應物的細胞來源。

中藥安全性的研究不充分、不明確是中藥走向國際的重大障礙之一。近年來中藥不良事件受到越來越多的關注，中藥安全性評價的標準化和國際化亟待解決。2019年中藥不良反應/事件報告顯示，從給藥途徑看注射給藥占比45.5%，從藥品類別上看活血化瘀藥報告數量仍居首位，在不良反應/事件中占比28.4%，嚴重不良反應/事件中占比39.8%[14]。而現有常用模型對藥物肝毒性預測缺乏靈敏性、準確性，動物實驗涉及到倫理和種屬差異問題使其應用受到限制，二維細胞缺乏長期培養的可能性，且缺少細胞-細胞相互作用及細胞-胞外基質相互作用而與人體實際狀況存在較大差異。比如曲伐沙星在臨床前研究中常用模型未得出肝毒性結論，隨后在上市一年后因導致肝衰竭和少數患者死亡而撤市[15]。而Nguyen等[16]將患者來源的肝細胞和非實質細胞共同打印成類肝組織，并利用其檢測到曲伐沙星的毒性。另有抗病毒核苷藥物非阿尿苷（Fialuridin）因在Ⅱ期臨床試驗中導致肝衰竭而被叫停, 它在動物實驗中沒有觀察到影響脂質積累或肝細胞功能損傷，但在肝臟芯片中發現其劑量依賴性地減少白蛋白分泌[17]。目前，中藥中特別存在的蓄積毒性不能在現有模型中得到較準確預測。本實驗室前期建立了活血化瘀類復方中成藥組分庫并提出了類器官在中藥安全藥理學應用的潛力[18-19]。在應用多維度高內涵2D細胞表型對中藥注射劑肝毒性評價方法[20]的基礎上，筆者將3D細胞打印和微流控芯片技術結合起來，構建三維動態類器官模型，用于中藥注射液安全性檢測。

1 材料

1.1 細胞系

HepG2細胞、EA.hy926細胞（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心）。

1.2 試藥

GelMA-60（蘇州EFL公司），DMEM基礎培養基、胎牛血清、胰蛋白酶（含EDTA）（美國Gibco公司），青鏈霉素（美國HyClone公司），Hoechst 33342、Calcein AM/PI（美 國Invitrogen公 司），D-山梨醇、甘油、4%多聚甲醛、TritonX-100、牛血清白蛋白Ⅴ（索萊寶生物科技有限公司），小鼠抗人白蛋白（ALB）抗體ab10241、兔抗人細胞色素P450 3A4（CYP3A4）抗體ab3572、山羊抗兔二抗 IgG H&L（AlexaFluor? 647）ab6721、驢抗小鼠二抗 IgG H&L（Alexa Fluor? 488）ab150105（英國Abcam 公司），雷公藤甲素（triptolide，TP）（天津中新藥業集團股份有限公司），阿司匹林（aspirin，ASP）（美國Sigma公司），香丹注射液（福建古田藥業有限公司，批號：2003093），冠心寧注射液（河北神威藥業有限公司，批號：Z13020780），參附注射液[華潤三九（雅安）藥業有限公司，批號：200705AK02]。

1.3 儀器

芯片主要部件由上海微技術工業研究院研制并提供，生物打印機與打印頭由上海傲睿流體科技有限公司研制并提供，打印機型號：BP4000，步進式蠕動泵（聯合眾為科技有限公司），Operetta高內涵篩選系統（美國PerkinElmer公司）。

2 方法

2.1 細胞打印

細胞傳代前調試Biot打印機與打印頭，使噴孔通暢，設置打印機x、y、z軸參數。將細胞稀釋至密度為1×106個·mL－1，離心并用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸。打印方法為：電壓11.5 V，聚集打印（單點），打印次數1次，循環次數5 circle（或打印次數5次，循環次數1 circle）。

2.2 微流控芯片小杯包被和鋪膠

2.2.1 包被 小杯即芯片內的細胞接種孔，將小杯倒置，用纖連蛋白（100 μL/孔）包被小杯孔背面的PET膜3 h，通過表面張力使其停留在PET膜上。

2.2.2 鋪膠 內皮細胞貼壁后，將小杯正向放置于完全培養基中，鋪Gel-MA 3D細胞培養膠（45 μL/孔），UV照射30 s使膠固化。芯片灌流速度通過步進式蠕動泵控制。

2.3 蛋白表達的免疫熒光檢測

培養14 d后，棄去舊培養液，PBS洗兩次，每次5 min；4%多聚甲醛室溫固定15 min，100 μL/孔；PBS洗兩次，每次5 min；scaleviwer透化液透化16 h（參考文獻自配[21]）；PBS洗兩次，每次5 min；2%BSA室溫封閉1～2 h，100 μL/孔；PBS洗兩次，每次5 min；適當稀釋比例一抗4℃孵育過夜，50 μL/孔；PBST洗兩次，每次5 min；適當稀釋比例二抗加Hoechst室溫孵育1～2 h；PBST洗兩次，每次5 min。1∶500稀釋的小鼠抗人白蛋白抗體，1∶1000稀釋的兔抗人細胞色素P450 3A4抗體共同4℃孵育過夜，50 μL/孔；PBST洗兩次，每次5 min；1∶1000稀釋的兩種二抗加Hoechst室溫孵育1～2 h；設置不加一抗的對照組，以去除假陽性結果。

2.4 細胞給藥

取基礎培養基稀釋藥液備用，類器官培養7～14 d后，棄去舊培養液，用基礎培養基洗兩次，加入稀釋好的藥液，每藥設3個復孔，37℃，5% CO2恒溫培養箱中繼續培養24 h。

2.5 熒光染色

用基礎培養基將每種熒光染料稀釋至終濃度為0.1 μg·mL－1的 Hoechst 33342，0.8 μmol·L－1的Calcein AM，1.5 μmol·L－1的PI染 液 備 用，棄去細胞培養板中的完全培養基，PBS洗兩次，加入熒光染料50 μL/孔，37℃避光孵育30 min，用基礎培養基洗板3次，每次5 min。

2.6 高內涵（HCA）檢測

根據各染料的吸收發射波長，對應濃度的曝光時間，在Operetta二代高內涵篩選系統中設置掃描方法，將板放入后，進行全自動細胞成像。用Harmony 4.9軟件對Operetta 成像進行分析，讀取細胞核熒光強度/細胞質熒光強度等數據。

2.7 數據統計分析

實驗數據均以均數±標準差（±s）表示，采用SPSS 21.0數據統計軟件，對數據進行正態性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析方法（One-Way ANOVA），數據按α＝0.05為檢驗水準，其中P＜0.05表示差異有統計學意義。所有數據作圖均由GraphPad Prism 6.0軟件生成。

3 結果

以人臍靜脈內皮細胞EA.hy926模擬血管，通過微流控技術流速控制的完全培養基，模擬血液流動過程中的力學微環境，營養供給和廢料排出，與3D培養的肝微球組合，構建人源肝臟類器官（見圖1A），并選取3種常用市售中藥注射劑進行肝臟安全性再評價。

3.1 微流控芯片條件優化

通過流速梯度實驗考察該體系中最合適的流速，通過包被方法改進延長灌流時間實現長期培養的目的。測試了33、99、297 μL·min－13個流速下未包被和采用包被纖連蛋白EA.hy 926的狀態，在兩組實驗中EA.hy926的狀態均不與流速成反相關，而是有一個適宜的區間范圍，其中流速為99 μL·min－1時EA.hy926保持貼壁時間最久，細胞延展性最好，狀態最佳。未包被情況下，33 μL·min－1和297 μL·min－1只能灌流培養到第2日，99 μL·min－1可灌流培養3 d（見圖1B）。此實驗證明99 μL·min－1處于最佳流速區間范圍，但未包被情況下細胞貼壁培養時間過短。

經過測試最有效的方法為10 μg·mL－1纖連蛋白包被3 h，完全培養基浸潤0.5 h后接種EA.hy926，貼壁24 h后以99 μL·min－1的流速灌流，過程中若遇細胞脫落較多時先暫停灌流，恢復8～24 h繼續灌流。結果EA.hy926連續貼壁培養時間達到14 d，其中灌流總時長達9～10 d（見圖1C）。其流速梯度測試的實驗結果與未包被一致，99 μL·min－1處于最佳流速區間，明顯 優 于33、297 μL·min－1。33 μL·min－1和297 μL·min－1流速下，一周內貼壁細胞逐漸掉落，細胞狀態差形狀回圓，高倍鏡下細胞輪廓不規則（見圖1C）。在灌流培養過程中觀察到細胞受到剪切力的作用而舒展狹長（見圖2B）并隨著液體流向排布（見圖2A）。結束灌流培養后對EA.hy926細胞進行緊密連接蛋白（ZO-1）和肌動蛋白（F-actin）免疫熒光染色（見圖2C），并與靜態培養14 d的EA.hy926細胞進行寬長比和細胞面積的比較，以證實剪切力的作用，動態灌流培養的細胞寬長比小于靜態培養細胞（見圖2D），面積大于靜態培養細胞（見圖2E）。

圖1 內皮細胞成功灌流培養14 d（50×）Fig 1 Endothelial cells were successfully perfused up to 14 days（50×）

圖2 剪切力對內皮細胞的影響（200×）Fig 2 Effect of shear force on the endothelial cells（200×）

3.2 3D打印細胞構建肝微球

采用圖3A所示3D生物打印機構建肝微球。將HepG2細胞重懸于PBS中進行打印，打印過程在0.5 h以內，此過程不影響細胞活性（見圖3D）。細胞3D打印成球后球體不斷增殖（見圖3E），HepG2打印成球后與EA.hy926灌流共培養14 d后，進行活死染色檢測肝實質細胞的存活率在70%左右（見圖3F）。肝類器官培養14 d后，通過免疫熒光法在肝實質細胞側檢測到ALB和CYP3A4的表達（見圖3G），在肝類器官上再現了部分肝功能性蛋白的表達。

圖3 3D生物打印的肝微球培養、細胞活/死、肝功能表達（200×）Fig 3 3D bio-printed cell culture，life and death and liver function expression（200×）

3.3 該模型用于評價中藥安全性

TP為已知具有肝毒性的中藥單體，故作為本實驗陽性藥，ASP作為陰性對照[22]，基于二代高內涵三維檢測成像細胞表型技術，共染Hoechst/Calcein AM/PI 3種染料，對3種常用市售活血化瘀中藥注射液進行肝毒性風險再評價。冠心寧注射液（GXNI）、參附注射液（SFI）、香丹注射液（XDI）濃度均為原藥的1/100。對照組（control，未處理）的細胞存活率為73.14%，各組藥物處理后的細胞存活率分別為：TP組53.32%，ASP組65%，XDI組58%，GXNI組71.13%，SFI組66%（見圖4B）。另僅TP有減小微球面積的趨勢（見圖4F）。核（Hoechst）染色顯示，SFI能增加核熒光強度（見圖4E）。內酯酶鈣黃綠素（Calcein-AM）染色顯示，TP顯著降低細胞活性，而XDI雖有降低細胞活性的趨勢，但與對照組相比差異無統計學意義。3種注射液與有明確肝毒性的TP比較，僅XDI組無明顯差異（見圖4C）。死細胞或凋亡晚期細胞PI染色顯示，TP顯著增加PI熒光強度，而XDI雖有增加PI強度的趨勢，但與對照組、TP組相比差異均無統計學意義，其他兩種注射液與TP組差異均有統計學意義（見圖4D）。 對3種市售活血化瘀中藥注射液的檢測提示XDI對細胞活性可能有一定抑制作用，可能通過促進細胞凋亡來實現；XDI在肝類器官芯片上單次給藥出現毒性趨勢，提示XDI在長時間、大劑量使用下對肝臟可能有一定影響，這需要進一步實驗驗證。

圖4 肝類器官用于中藥注射液肝毒性評價的代表圖像和定量結果（200×）Fig 4 Representative images and quantitation of hepatotoxicity risk assessment of hepatic organs with TCM injection（200×）

4 討論

本文首次在中藥安全性評價領域將3D生物打印與微流控兩種新興技術結合，構建更先進的模型。微流控技術營造力學微環境，輸送營養物質，對模擬人體器官生理狀態至關重要，大量文獻表明，灌流培養可促進細胞因子分泌，增強功能表達[12，23]。本文使用蠕動泵，定時更換培養基，簡單模擬血液循環和廢料排出，確立最佳流速為99 μL·min－1，為內皮細胞提供了更接近實際血管的剪切力，使內皮細胞延展，沿液體流向排列，貼壁細胞面積大于靜態培養的細胞。蠕動泵使培養基循環流動，節省培養基。包被纖連蛋白和提前完全培養基浸潤的操作，使內皮細胞貼壁更加牢固，在較大的流速灌流下（99 μL·min－1）也能保持14 d的貼壁培養。芯片中設計了4個獨立的流道，可實現不同流速同時灌流，即可同時模擬血液流速較高的大血管和血液流速低的毛細血管，以及不同血管周邊的組織情況。芯片與高內涵配適，可實現高通量篩選和數據處理。3D生物打印具有快速、精準、經濟的優勢，在構建復雜精確的組織器官方面具有廣闊的應用前景。本課題組通過軟件設計的打印方法，打印肝細胞成微球，與內皮細胞共培養。內皮細胞、肝星狀細胞、Kupffer細胞這些非實質細胞與肝實質細胞共培養，有利于肝功能的發揮[24]。本文中肝功能相關的ALB和CYP3A4蛋白可正常表達，肝細胞培養14 d可保持70%活性。

本文運用微流控芯片和細胞3D打印摸索而來的最優條件組合，構建肝類器官并用于中藥注射液肝毒性再評價，結果提示該模型評價肝毒性比2D細胞模型更準確；XDI有潛在肝風險。TP的肝毒性來源于原形化合物，代謝是其解毒途徑[25-27]，研究表明CYP450系列酶在三維細胞中的表達遠高于二維細胞[28-29]，因此TP在三維細胞的毒性弱于二維細胞。本文結果符合這一預期，與文獻中2D HepG2 細胞達到相同損傷程度[30]，本文所構建的肝類器官所需TP 濃度更高（2D 細胞為630 nmol·L－1，本文模型為1 μmol·L－1）。同樣的，對XDI的肝毒性評價中，2D HepG2細胞與該肝類器官相比，相同濃度下2D細胞活性明顯被抑制[19]，該模型細胞活性無明顯抑制，但顯示抑制趨勢。XDI的不良反應多見于呼吸系統、皮膚、胃腸系統，偶發肝炎、肝硬化[31-33]。在本課題組前期動物實驗中[19]，XDI在經典肝毒性生化指標上（超氧化物歧化酶、丙二醛、谷氨轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶）也表現為毒性趨勢。綜上，臨床報告、動物實驗中XDI的肝毒性并非普遍存在，但有偶發風險。可能與劑量、用藥時長有關，需要進一步驗證。因而，從TP和XDI的結果來看，該肝類器官模型比2D細胞模型更準確。該模型可長期培養、重復給藥，準確度高，有拓展通量的潛力，對動物的需求少，適用于具有復雜化學成分、蓄積毒性的中藥制劑。可用于經由2D細胞初篩后，進一步肝毒篩選檢測和毒性機制研究。

為了使肝類器官更完善，本課題組下一步將按比例加入星狀細胞和免疫細胞；根據打印機特點設計多細胞打印圖案。類器官芯片的現階段作用通常是彌補動物實驗和2D細胞實驗之間的鴻溝，代替并超越動物實驗的人體芯片時代值得我們期待。隨著生物打印機設計、材料學、生物學等相關學科的進步，尤其是與AI/機器學習領域的結合，類器官芯片可能會取得突破性進展，也必然會為藥物研發領域帶來新的機遇。材料學和AI/機器學習應用到類器官領域的長足發展可能會使類器官形似人體器官更容易，而形似這一帶著整體論色彩的研究方法或許會給神似（功能性）帶來意想不到的進步。