灰氈毛忍冬苯丙氨酸解氨酶（LmPAL2）基因的 克隆與表達分析

王珊，陳勛，龍雨青，童巧珍，劉湘丹*，周日寶*（1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，長沙 410005；2.湖南中醫藥大學藥學院，長沙 410208；.南華大學附屬南華醫院，湖南 衡陽 421002；4.湖南省中藥飲片標準化及功能工程技術研究中心，長沙 410208；5.湖南省普通高等學校中藥現代化研究重點實驗室，長沙 410208）

灰氈毛忍冬Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.來源于忍冬科，收載于《中國藥典》2020年版山銀花項下，具有清熱解毒、疏散風熱的功效，是臨床常用中藥之一。自《中國藥典》2005年版將金銀花與山銀花分列后，學者們對兩者開展了多項對比研究[1-2]，其中主要活性成分綠原酸的含量測定結果顯示，灰氈毛忍冬顯著高于忍冬。大量研究表明，綠原酸具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化和抗炎等作用[3]，灰氈毛忍冬作為提取綠原酸的主要原料之一，具有較高的經濟價值和良好的市場應用前景。以往提高綠原酸含量的研究多集中在提取工藝和加工炮制等方面[4-5]。近些年，隨著分子生物學的快速發展，對灰氈毛忍冬綠原酸生物合成途徑的相關基因研究逐漸成為熱點。有學者研究發現，綠原酸的生物合成可能與苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、羥基肉桂轉移/羥基肉桂酰輔酶A奎尼酸轉移酶（HCT/HQT）和香豆酸羥化酶（C3H）等重要酶有關[6]。目前已有關于灰氈毛忍冬HQT基因[4，7]、LmCCoAOMT基因[8]、4CL基因[9]，以及本項目組的PAL1基因[10]和C3H1基因[11]等陸續被克隆，這些基因皆被認為是參與調控綠原酸生物合成途徑的關鍵基因。綠原酸為苯丙素類物質，其合成與苯丙烷代謝密切相關[12]。PAL 作為苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶和限速酶，對綠原酸的合成有著促進作用[13]。

本研究以灰氈毛忍冬的花、莖和葉為材料，根據項目組前期獲得的灰氈毛忍冬轉錄組數據庫的相關序列設計引物，利用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）和擴增技術（RACE），克隆灰氈毛忍冬PAL2（LmPAL2）基因，對其進行生物信息學分析。再采用qRT-PCR 技術測定其在不同花期和不同部位的表達量，并進行分析，為進一步探究LmPAL2基因在參與灰氈毛忍冬綠原酸生物合成中的調控作用提供參考依據。

1 材料

1.1 藥材

灰氈毛忍冬材料均采摘于湖南中醫藥大學藥植園，取開花進程中的7個花期的花[10]以及莖、葉，經湖南中醫藥大學周日寶教授鑒定為灰氈毛忍冬的花、莖及葉，于－80℃ 冰箱保存。

1.2 試藥

Biospin 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（杭州博日科技有限公司），RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit（Thermo公司），Gel Extraction Kit、2×Taq MasterMix（Dye）和2×Pfu MasterMix（Dye）（康為世紀生物科技有限公司），pEASY-T1 Cloning Vector、pEASY-Blunt Cloning Vector和TranStart Green qPCR SuperMix UDG（北京全式金生物科技有限公司），SMARTer RACE 5’/3’ Kit（Clontech 公司）。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成（序列見表1），濃度均為10 μmol·L－1。

表1 引物序列 Tab 1 Primer sequence

2 方法

2.1 LmPAL2 基因克隆

2.1.1 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成 取灰氈毛忍冬白色花蕾期的花適量，參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒的步驟提取總RNA[14]，分別于瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳和微量分光光度計檢測RNA的完整性及純度。根據Thermo反轉錄試劑盒說明書，將提取的RNA反轉錄合成cDNA第一鏈。

2.1.2LmPAL2基因核心片段擴增 從本課題組前期獲得的灰氈毛忍冬轉錄組測序結果中，篩選出標注為PAL的序列，應用Primer Premier 軟件設計特異性引物PAL2-F和PAL2-R（見表1），以cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增。PCR反應體系與擴增程序參考文獻[10]，其中引物為PAL2-F和PAL2-R。對PCR擴增產物進行電泳檢測，利用膠回收試劑盒回收目的條帶，按照pEASY-T1 Cloning Vector 說明書的步驟進行連接、轉化、篩選，將挑選出的白斑進行菌液PCR，并委托上海生工生物工程有限公司測序。

2.1.3LmPAL2基因5’-和3’-RACE擴增 根據“2.1.2”項下測得的LmPAL2基因核心片段設計5’-和3’-RACE 引物PAL2-5’和PAL2-3’（見表1）。按照RACE 試劑盒說明書分別合成LmPAL2基因的5’-和3’-RACE-Ready cDNA，再分別進行5’-及3’-RACE擴增。PCR反應體系與擴增程序參考文獻[10]，其中引物為PAL2-5’和PAL2-3’?；厥誖ACE 擴增產物和T載體克隆等同“2.1.2”項下，所用載體為Blunt。

2.1.4LmPAL2基因cDNA全長的獲得及驗證 采 用Conting Express軟 件 對5’-和3’-端 序列進行拼接，得到LmPAL2基因的cDNA序列全長。根據序列全長設計驗證引物V-PAL2-F和V-PAL2-R（見 表1），以“2.1.1”項 下 得 到的cDNA第一鏈為模板進行全長驗證。PCR反應體系與擴增程序參考文獻[10]，其中引物為V-PAL2-F 和V-PAL2-R。回收目的條帶、克隆等同“2.1.2”下，所用載體為Blunt。

2.2 LmPAL2 基因生物信息學分析

應用NCBI 在線軟件查找LmPAL2基因的ORF，通過ProtParam 軟件在線預測其編碼蛋白的分子量、分子式、不穩定系數及等電點等；利用ProtScale 軟件測定其蛋白親/疏水性；采用WOLF PSORT 在線預測蛋白質亞細胞定位情況；TMHMM 分析蛋白質的跨膜結構；SignalP 4.1 Server 預測信號肽；InterProScan分析蛋白質結構域；SOPMA和SWISS-MODEL分別預測蛋白質的二級和三級結構；通過NCBI的蛋白質序列數據庫進行BLAST 比對，篩選出同源性較高的物種，再利用DNAMAN 軟件進行氨基酸多重序列比對，并用MEGA軟件構建系統進化樹。

2.3 LmPAL2 基因在不同花期和不同器官的表達

根據LmPAL2基因cDNA全長序列，設計熒光定量PCR的特異性引物Q-PAL2-R 和Q-PAL2-F（見表1）。采用“2.1.1”項下灰氈毛忍冬7個花期的花及莖、葉的RNA，定量至100 ng·μL－1后反轉錄合成各自的cDNA第一鏈，以18 S rRNA為內參基因，在熒光定量PCR 儀上進行qRT-PCR。反應體系與擴增程序參考文獻[10]，其中引物為Q-PAL2-R和Q-PAL2-F。每個樣品重復3次，采用2－ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

3 結果與分析

3.1 LmPAL2基因克隆

3.1.1 總RNA的提取 灰氈毛忍冬花總RNA電泳結果見圖1，28 S和18 S條帶清晰可見，其中28 S條帶亮度約為18 S的2倍，提示提取的總RNA完整性良好，A260/A280值在1.8～2.0，A260/A230值＞2.0，說明總RNA質量較好，能夠滿足后續實驗要求。

圖1 總RNA電泳圖Fig 1 Electrophoresis of total RNA

3.1.2LmPAL2基因核心片段擴增 通過RT-PCR擴增得到約700 bp的單一條帶（見圖2），經過回收、T載體克隆與測序，確定該核心片段序列長為693 bp。采用DNAMAN比對，與轉錄組測序所得序列基本一致。

圖2 LmPAL2基因核心片段擴增產物Fig 2 PCR product core fragment of LmPAL2 gene

3.1.3LmPAL2基 因5’-和3’-RACE擴 增 及cDNA全長驗證5’-和3’-RACE擴增結果均提示在1300 bp附近有一亮帶（見圖3A及3B）。將5’-和3’-端測序結果與核心片段序列拼接后，得到LmPAL2基因cDNA全長序列2425 bp。對其進行全長驗證，在2400 bp左右發現一明顯亮帶（見圖3C），將亮帶回收、克隆并測序，結果與拼接全長序列一致。

圖3 LmPAL2 基因克隆凝膠電泳Fig 3 Clone gel electrophoresis map of LmPAL2 gene

3.2 LmPAL2 基因生物信息學分析

3.2.1 蛋白理化特性 灰氈毛忍冬PAL2基因全長2425 bp，包含一個2124 bp的ORF，序列編碼707個氨基酸（見圖4），命名為LmPAL2，其GenBank登錄號為：MH779889。推測其分子式為C3402H5441N949O1038S25，相對分子質量為77.05 kD，等電點為6.23，不穩定系數為32.51，屬于穩定蛋白，親水性平均系數為－0.207，預測其為親水性蛋白。亞細胞定位推測LmPAL2蛋白可能定位于葉綠體中。蛋白跨膜結構預測該基因編碼的氨基酸均在膜外，不具有跨膜區域。信號肽預測分析，LmPAL2蛋白中無信號肽序列，推測其為非分泌蛋白。

圖4 LmPAL2全長序列及推測的氨基酸序列Fig 4 Full-length cDNA sequence of LmPAL2 gene and predicted amino acid sequence

3.2.2 蛋白結構域和二、三級結構 蛋白結構域預測LmPAL2蛋白屬于PAL家族，包含PAL 保守結構域，并且含有PAL/HAL 活性中心序列GTITASGDLVPLSYIAG。LmPAL2 蛋白的二級結構預測，其組成以α-螺旋和隨機卷曲為主，分別占55.59%和29.56%。LmPAL2 蛋白的三級結構預測結果見圖5。

圖5 LmPAL2 蛋白三級結構預測圖Fig 5 Prediction of tertiary structure of LmPAL2 protein

3.2.3 氨基酸序列同源性比對和系統進化樹分析LmPAL2氨基酸序列同源性比對結果顯示，其 與 忍 冬Lonicera japonica（AGE10590.1）、葡萄Vitis vinifera（ANB59163.1）、獼 猴 桃Actinidia deliciosa（QED11030.1）、山 茶 花Camellia japonica（AFJ80777.1）、唐 松 草Thalictrum thalictroides（KAF5182779.1）、梨Pyrus bretschneideri（ASV49150.1）及 罌 粟Papaver somniferum（XP_026403210.1）的同源性在84.27%～99.15%。氨基酸多重序列比對結果見圖6，分析發現這些物種均含有GTITASGDLVPLSYIAG 酶活性中心序列。

圖6 LmPAL2 與其他植物PAL 蛋白的多序列比對分析Fig 6 Multiple sequence alignment of LmPAL2 and other plant PAL proteins

從NCBI 中下載與LmPAL2同源性較高的部分植物PAL基因家族氨基酸序列，應用MEGA軟件構建NJ 系統進化樹（見圖7）。系統進化樹主要聚為三支，灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides與忍冬Lonicera japonica、向日葵Helianthus annuus、罌粟Papaver somniferum、獼猴桃Actinidia deliciosa、柑橘Citrus clementina以及梨Pyrus bretschneideri聚為一支，其中與同科同屬的忍冬親緣關系最近。

圖7 LmPAL2 蛋白的NJ 系統進化樹Fig 7 Neighbor-joining phylogenetic tree of LmPAL2 proteins

3.3 LmPAL2 基因不同花期和不同器官的表達分析

LmPAL2基因在不同花期的相對表達量結果表明，其在綠白色花蕾期表達強烈，花蕾初期、青綠色花蕾期和金黃色花期次之，枯萎期表達量最低（見圖8）。而LmPAL2基因在不同器官中的相對表達量結果顯示，葉中的表達量最高，其次是白色花蕾期，莖中最低（見圖9）。

圖8 LmPAL2基因在不同花期中的相對表達量Fig 8 Relative expression of LmPAL2 gene in different flowering stages

圖9 LmPAL2基因在不同器官中的相對表達量Fig 9 Relative expression of LmPAL2 gene in different organs

4 討論

本研究克隆得到PAL2基因cDNA序列全長，其中ORF為2124 bp，編碼707個氨基酸。與本項目組前期獲得的PAL1基因ORF為2145 bp，編碼714個氨基酸相比[10]，存在稍許差異，這也驗證了同一植物多基因家族中的各個基因編碼長度不盡相同[15]。同源性比對結果顯示，LmPAL2與LmPAL1的相似度為82.77%。兩者均含有PAL典型結構域和活性中心，只是氨基酸的位點有所不同。

PAL是催化苯丙烷類代謝第一步反應的限速酶，在植物次生代謝、生長發育和防御中發揮著重要的作用[16]。因此，PAL基因在許多植物中得到廣泛的研究。蓖麻RcPAL基因表達上調時木質素含量顯著增加，下調時則相反，表明RcPAL基因是蓖麻木質素生物合成的關鍵基因[17]。膜莢黃芪中的AmPAL2基因的表達可能與毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累密切相關[18]。茉莉花JsPAL2基因可能與茉莉花香氣物質的合成有關[19]。水稻OsPALS基因通過調節水楊酸和木質素的生物合成和積累，提高水稻對褐飛虱的抗性[20]。關于PAL參與綠原酸生物合成的功能研究也早已開展。大豆PAL2基因轉化煙草后，轉基因植株葉中的PAL轉錄水平提高5倍，且葉中綠原酸含量顯著增加[21]。擬南芥AtPAL2基因在轉基因煙草中的過表達使綠原酸的含量增加了1倍[22]。忍冬LjbZIP8在轉基因煙草中過表達通過抑制NtPAL1、NtPAL2和NtPAL4的表達，降低了新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的含量，也間接說明PAL是綠原酸生物合成途徑中的關鍵基因[23]。

在大多數植物中，PAL基因屬于一個基因家族，PAL家族的每個成員表現出明顯的表達模式和活性差異[24]。如忍冬LJPAL1和LJPAL3基因的表達量花蕾＞葉，而LJPAL2則為花蕾略低于葉[25]。紅腺忍冬LHPAL1基因的表達量花蕾＞葉，LHPAL2和LHPAL3基因的表達量則為葉＞花蕾[25]。華南忍冬PAL1基因的表達量為葉＞花蕾，PAL2基因花蕾略低于葉，PAL3基因則花蕾明顯高于葉[26]?；覛置潭琇mPAL1基因的表達量為白色花蕾期花＞莖＞葉[10]，而LmPAL2則為葉＞白色花蕾期花＞莖。這也提示PAL基因家族成員在苯丙氨酸代謝途徑的功能調控中存在差異。

本研究中LmPAL2基因在綠白色花蕾期強烈表達，結合課題組前期研究，灰氈毛忍冬不同花期的綠原酸含量測定結果顯示，從綠白色花蕾期開始，綠原酸的含量逐漸上升，至金黃色開花期達到峰值[11]，初步推測LmPAL2表達豐度的升高，促進了后期綠原酸的合成。后續可通過構建植物表達載體，轉入轉基因植株以開展LmPAL2基因參與綠原酸合成的功能驗證研究。

本研究完成了灰氈毛忍冬LmPAL2基因的克隆，并比較了其在不同花期和不同器官的表達差異，為進一步研究灰氈毛忍冬次生代謝產物綠原酸積累的分子調控機制提供依據，為通過基因工程技術培育出綠原酸含量更高的優良品種奠定基礎。