牛膝和白芍配伍對帕金森病肝陽上亢證小鼠的 協同神經保護作用及機制研究

張靜艷，郭科東，金明，榮華，張曉杰（1.黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，哈爾濱 150000；.齊齊哈爾醫學院病理學院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；3.黑龍江護理高等專科學校，哈爾濱 150000）

關健詞：帕金森病；肝陽上亢證；牛膝；白芍；氧化應激；核因子NF-E2相關因子2；血紅素氧合酶1

帕金森病（Parkinson disease，PD）是中老年人群常見的椎體外系神經退行性疾病，以靜止性震顫、姿勢異常、行動障礙為主要臨床表現，嚴重者會造成情緒、記憶及認知功能障礙。中腦黑質致密部大量多巴胺（dopamine，DA）能神經元進行性丟失及路易小體異常聚集為其典型的病理表現[1]。PD患者腦組織抗氧化酶活性顯著減少，脂質過氧化水平異常增加[2]，而活性氧形成過量和DA能神經元功能障礙及死亡密切相關[3]。目前，尋找具有抗氧化能力及神經保護作用的藥物已經成為PD治療的重要方向[4]。

鎮肝熄風湯為《醫學衷中參西錄》的經典方劑，具有良好的抗氧化作用，在肝陽上亢型PD的治療實踐中已經取得顯著療效[5-6]。然而大復方由于成分眾多，藥味間作用關系復雜，藥物配伍在復方中的真實作用難以準確反映。牛膝與白芍是鎮肝熄風湯的核心藥對，是治療PD方劑中出現頻率較高的藥對，課題組前期體外實驗已經證實，牛膝與白芍有效組分配伍對DA能神經元具有協同增效的神經保護作用[7]，但其配伍的體內實驗及抗PD的具體機制鮮有研究。本研究采用中醫特色明顯的病證結合動物模型，通過行為學實驗、生化檢測及分子生物學等方面探討牛膝和白芍配伍對PD肝陽上亢證小鼠氧化應激反應的調節機制，為臨床中藥復方的二次開發及應用提供實驗基礎。

1 材料

1.1 動物

SPF級8周齡健康C57BL/6雄性小鼠90只，體質量（20±2）g [遼寧長生生物技術股份有限公司，動物許可證號：SCXK（遼）2020-0001]。飼養條件：室溫25℃，濕度40%～50%。

1.2 試藥與儀器

附子（湖北金貴中藥產業有限公司，批號：D4120201）；牛膝、白芍（北京同仁堂有限公司，批號：801000130、801001062），分別取附子、牛膝、白芍及牛膝白芍配伍組4組飲片按傳統煎藥法制成含附子、牛膝、白芍及牛膝白芍配伍組（生藥量分別為0.2、0.33、0.17、0.5 g·mL－1）水煎液。鎮肝熄風湯（齊齊哈爾醫藥商廈，相當于生藥量為1.67 g·mL－1，經齊齊哈爾醫學院藥物研究所鑒定專家進行鑒定）；1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP，美國Sigma公司，批號：M0896）；兔抗鼠酪氨酸羥化酶（TH，批號：58844S）、Lamin B抗體（批號：13435S）（CST公司）；兔抗鼠核因子NF-E2相關因子2（Nrf2）、血紅素氧合酶1（HO-1）抗體（Abcam公司，批號：ab137550、ab189491）；谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為：A003-4-1、A001-3-2、A006-1-1）。全自動凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；SA102轉棒式動物疲勞測試儀（江蘇賽昂科技有限公司）。

2 方法

2.1 模型建立與給藥

小鼠隨機分為對照組、模型組、鎮肝熄風湯組、牛膝組、白芍組及牛膝白芍配伍組，每組15只。除對照組外，各組給予附子湯（3 g·kg－1）灌胃4周制備肝陽上亢證動物模型[5]。附子灌胃結束后，牛膝、白芍及牛膝白芍配伍組分別按4.5、2.3、6.8 g·kg－1灌胃給予相應藥物水煎液，鎮肝熄風湯組給予鎮肝熄風湯（25 g·kg－1），1次·d－1，連續灌胃給藥14 d。于給藥第10日開始，灌胃給藥前1 h，模型組及各給藥組小鼠連續5 d腹腔注射MPTP（30 mg·kg－1）制備PD肝陽上亢病癥結合小鼠模型[8]。造模結束后以小鼠出現易激惹、豎毛、弓背、震顫、抽搐等癥狀即視為模型建立成功[9]。本次模型制備全部成功。

2.2 小鼠易激惹程度的評定

易激惹程度分為3級：Ⅰ級為小鼠頭頸部被捉持時立即表現出尖叫、驚跳等癥狀；Ⅱ級為小鼠頭頸部被捉持時表現出攻擊行為；Ⅲ級為小鼠尾部被提起時即表現出尖叫、驚跳或攻擊行為。Ⅰ～Ⅲ級均不出現者為0級，實驗結束前測量1次[10]。

2.3 行為學檢測

2.3.1 曠場實驗 實驗前適應環境1 h。實驗時將小鼠放于曠場箱（50 cm×50 cm）中央，采用曠場實驗分析系統記錄小鼠運動總路程，測試時間為5 min[11]。

2.3.2 轉棒實驗 實驗前對小鼠進行預先訓練，轉速30 r·min－1，訓練時間為3 min，連續訓練2 d。實驗時以0.12 r·min－1的加速度從4 r·min－1開始恒定加速，最大轉速為40 r·min－1，記錄小鼠在5 min內，在轉棒上停留的時間，即轉棒掉落潛伏期[12]。

2.4 免疫組化法分析TH陽性神經元平均光密度

黑質區取材進行石蠟包埋切片，脫蠟，抗原修復，3%H2O2封閉。PBS漂洗后滴加兔抗TH多克隆抗體（1∶200），室溫孵育。PBS漂洗后滴加羊抗兔二抗孵育1 h。DAB工作液顯色，蘇木素復染，PBS充分沖洗返藍并封片。在顯微鏡下觀察黑質中TH表達陽性的神經元并拍片，根據Image-Pro Plus 6.0軟件計算各組平均光密度。

2.5 氧化應激指標測定

于冰上取適量小鼠腦黑質，加入9倍預冷的生理鹽水制備10%組織勻漿，離心（2500 r·min－1，15 min）后取上清液，按照試劑盒說明采用生物化學法測定GSH與MDA的表達水平及SOD的活性。

2.6 Western blot檢測相關蛋白表達

冰上取腦組織剪碎，加入蛋白酶抑制劑及裂解液震蕩混勻，以12 000 r·min－1離心10 min，取上清液即為所提蛋白溶液。另取腦黑質按照核蛋白抽提試劑盒說明書抽提核蛋白，均采用BCA法進行蛋白定量。SDS凝膠電泳分離蛋白，轉膜、封閉。分別加入一抗Nrf2（1∶1000）、HO-1（1∶1000）、β-actin（1∶500）及Lamin B（1∶1000），于4℃孵育過夜，二抗（1∶6000）孵育，TBST緩沖液洗膜。ECL化學發光法顯影后，采用AlphaEase FC圖像分析軟件對免疫印跡條帶進行分析。

2.7 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD方法，等級資料采用Ridit分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 牛膝白芍配伍對小鼠易激惹程度的影響

與對照組相比，模型組小鼠易激惹程度明顯增加；與模型組相比，鎮肝熄風湯組、牛膝組、白芍組及配伍組均可不同程度改善小鼠的易激惹程度（見表1）。

表1 各組小鼠易激惹程度的比較(n＝15) Tab 1 Irritation degree of the mice in each group (n＝15)

3.2 牛膝白芍配伍對小鼠行為學的影響

與對照組相比，模型組小鼠曠場運動總距離明顯減少、轉棒掉落潛伏期明顯縮短；與模型組相比，各給藥組均可不同程度增加小鼠曠場運動總距離、延長轉棒掉落潛伏期；配伍組作用明顯優于牛膝和白芍單獨用藥組；配伍組與鎮肝熄風湯組相比，差異無統計學意義（見圖1及圖2）。

圖1 各組小鼠曠場實驗運動軌跡Fig 1 Movement trajectory of the mice in each group in the open field experiment

圖2 各組小鼠行為學比較（±s，n＝15）Fig 2 Behavioral comparison of mice in each group（±s，n＝15）

3.3 牛膝白芍配伍對小鼠神經細胞TH陽性表達比較

與對照組相比，模型組黑質TH陽性表達明顯減少；與模型組相比，各給藥組可不同程度增加TH陽性表達水平；與牛膝、白芍單獨用藥組相比，配伍組TH陽性表達增加更為明顯；配伍組與鎮肝熄風湯組相比，差異無統計學意義（見圖3）。

圖3 各組小鼠黑質神經細胞TH陽性表達的比較（±s，n＝5）Fig 3 Positive expression of TH in the substantia nigra of the mice in each group（±s，n＝5）

3.4 牛膝白芍配伍對小鼠腦組織氧化應激指標的影響

與對照組相比，模型組小鼠腦黑質抗氧化物質SOD活性、GSH水平明顯降低，氧化物質MDA水平明顯增高；與模型組相比，鎮肝熄風湯組、牛膝組及配伍組可不同程度逆轉SOD活性、GSH及MDA的水平，而白芍組對改善氧化應激作用不明顯；配伍組改善氧化應激效應明顯優于牛膝、白芍單獨用藥組；配伍組與鎮肝熄風湯組相比，差異無統計學意義（見圖4）。

圖4 各組小鼠腦組織氧化應激指標的比較（±s，n＝6）Fig 4 Oxidative stress index of the mice in each group（±s，n＝6）

3.5 牛膝白芍配伍對小鼠腦組織Nrf2、HO-1蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組黑質核Nrf2蛋白、漿HO-1蛋白表達水平未見明顯差異；與模型組相比，鎮肝熄風湯組、牛膝組及配伍組核Nrf2、漿HO-1蛋白表達量均明顯增加，而白芍組蛋白表達雖有增加趨勢，但差異無統計學意義；配伍組蛋白表達明顯優于牛膝、白芍單獨用藥組；配伍組與鎮肝熄風湯組相比，差異無統計學意義（見圖5）。

圖5 小鼠腦組織Nrf2、HO-1蛋白表達比較（±s，n＝5）Fig 5 Nrf2 and HO-1 protein expression in the brain tissue of mice（±s，n＝5）

4 討論

隨著社會人口老齡化趨勢的逐年加重，PD的發病率日益增加，如何對該疾病進行有效治療已成為醫藥界研究的重點課題[13]。西醫治療PD不良反應明顯，長期持續治療藥效減退，且不能阻止病情的進展[14]。肝腎陰虛、肝陽上亢是PD的核心中醫病機，臨床研究報道了鎮肝熄風湯對PD肝陽上亢證的防治，療效確切[15]。然而中藥大復方藥味繁多，藥對的具體作用難以在方劑中研究與確定。牛膝白芍是鎮肝熄風湯的核心配伍藥對，牛膝補益肝腎、引火下行，具有明顯的抗氧化、調節免疫作用[16-17]；白芍養血濡筋、緩急止痙，具有神經保護、鎮痛抗炎作用[18]。前期體外實驗表明，牛膝和白芍的主要有效成分能抑制魚騰酮誘導的PC12細胞凋亡，有效成分配伍后作用增強[7]。基于“組分配伍研制現代中藥”的理念，本課題組提取鎮肝熄風湯的君藥牛膝和臣藥白芍為核心配伍藥對，探討兩者配伍對DA能神經元是否具有協同神經保護作用及具體作用機制。

附子辛燥大熱，久服耗傷陰血，附子灌胃可制備肝陽上亢證動物模型，使動物出現煩躁、易怒（易激惹）癥狀[5，10]；MPTP是嚙齒及靈長類PD研究中使用最多的外源性神經毒素，可選擇性損傷DA能神經元并誘導PD的發生發展[19]。研究表明，由MPTP復制的PD模型小鼠的運動功能明顯異常且DA能神經元數量顯著減少[20]。TH是催化DA、腎上腺素等神經遞質合成的限速酶[21]，常用于驗證PD模型是否構建成功，細胞表達TH是判斷DA能神經元數目的黃金標準[22]。本實驗結果表明，以附子灌胃聯合腹腔注射MPTP制備的PD肝陽上亢證小鼠模型，其激惹程度明顯增加，曠場運動總距離明顯減少，轉棒掉落潛伏期明顯縮短，TH陽性表達減少，人類肝陽上亢型PD的行為特征及病理特點在本實驗小鼠模型中得到了較好的模擬。本研究發現，各給藥組可不同程度降低小鼠激惹程度，增加曠場運動總距離，延長轉棒掉落潛伏期，減少TH陽性神經元的丟失，說明牛膝、白芍及兩者配伍均可有效改善小鼠肝陽上亢癥狀及運動功能障礙，減少DA能神經元損傷，并且配伍組比單獨用藥組的治療效果更為顯著。

PD的發生與氧化應激密切相關[22]，研究表明神經毒素MPTP會使神經元產生大量氧自由基而誘發氧化應激[23]。氧自由基使神經元膜結構被氧化，產生大量MDA，使得DA能神經元變性及缺失[24]，因此MDA可間接反映組織氧化損傷的水平[25]。為應對過度氧化，機體在氧化應激刺激下產生抗氧化物SOD及GSH。SOD可抑制氧自由基生成[23]，GSH對氧化應激產物進行還原[27]，SOD及GSH水平體現機體對抗氧化損傷的能力[28]。為檢測小鼠腦內氧化應激的損傷程度，本課題組檢測了氧化與抗氧化反應的標志物。結果發現，模型組小鼠黑質MDA含量明顯增高，SOD及GSH水平明顯降低，說明模型組小鼠腦內氧化應激損傷明顯。而經藥物治療后，牛膝組及配伍組小鼠腦內氧化應激反應出現不同程度的改善，且配伍組改善氧化應激的效果較優。

Nrf2是誘導機體產生抗氧化酶以對抗氧化應激的重要因子[29]。在細胞發生氧化應激或受內源性、外源性反應性物質如H2O2、超氧化物攻擊時，生理條件下位于細胞質中非活性狀態的Nrf2蛋白被激活，與其結合蛋白發生解離，轉位至細胞核，誘導SOD、GSH的表達，減少脂質過氧化物MDA生成，并啟動下游抗氧化酶HO-1的轉錄[30-31]。研究發現，HO-1能保護器官免受氧化應激[32]，其表達減少與PD等年齡依賴性疾病的發病機制有關[33]。本研究表明，牛膝組及配伍組均可促進神經細胞Nrf2的核內表達并誘導其下游產物HO-1轉錄增加，改善腦內的氧化應激狀態，其中配伍組效應最強，其作用與鎮肝熄風湯相當，而白芍組對PD肝陽上亢證小鼠雖有抗氧化趨勢，但作用不明顯。本實驗結果說明，牛膝與白芍雖對PD肝陽上亢證小鼠均具有神經保護作用，但兩者在抗氧化及相關靶通路發揮的作用仍存在差異，白芍在兩者配伍中發揮的作用將另文報道，牛膝白芍配伍發揮抗氧化作用的機制與牛膝的抗氧化功能相關，兩藥配伍后發揮協同增效的神經保護作用。

綜上，牛膝白芍配伍可有效改善PD肝陽上亢證小鼠的易激惹程度及行為障礙，保護DA能神經元，兩藥配伍具有協同作用，其機制可能是通過牛膝激活Nrf2/HO-1信號轉導通路發揮抗氧化作用。本實驗證明牛膝白芍兩藥配伍在治療PD肝陽上亢證方面存在相使作用，雖然其治療機制有待進一步研究，但是本實驗為中藥配伍“相使增效”的科學理論及中藥大復方的二次優化升級提供了更多實驗依據。