紅毛七中一個(gè)新的羽扇豆烷型三萜皂苷

劉渝，湯海峰，王玉梅，陸云陽(yáng)，張倩，劉楊，畢琳琳（1.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院采購(gòu)中心，西安 71003；.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系中藥與天然藥物學(xué)教研室，西安 71003；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 71046）

紅毛七為小檗科（Berberidaceae）紅毛七屬植物類(lèi)葉牡丹Caulophyllum robustumMaxim.[Leontice robustumDiels]的根及根莖，因其須根多而細(xì)呈紫紅色，故得此名，又名金絲七、搜山貓、紅毛細(xì)辛、火焰叉、通天竅、葳嚴(yán)仙、海椒七、雞骨升麻等。類(lèi)葉牡丹主要分布于我國(guó)東北地區(qū)及陜西、湖北等地，藥材作為陜西七藥（太白七藥）之一，具有活血散瘀、祛風(fēng)止痛、降血壓、止血、解草烏中毒功效，主治月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)期小腹疼痛、關(guān)節(jié)炎、高血壓等癥[1-2]。紅毛七主要含有三萜皂苷、生物堿以及甾醇等成分，已從中分離鑒定了上百個(gè)化合物，其中三萜皂苷類(lèi)50余個(gè)，所涉及的10余種苷元均屬于齊墩果烷型。現(xiàn)代藥理研究表明紅毛七提取物及其皂苷、生物堿等成分具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗心肌缺血等作用[3-4]。對(duì)紅毛七的研究報(bào)道甚多，但仍不斷有新的化學(xué)成分被發(fā)現(xiàn)，本課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)提示陜西產(chǎn)地紅毛七與東北等其他產(chǎn)地的藥材在化學(xué)成分上可能存在一定差異。基于課題組前期對(duì)陜產(chǎn)紅毛七化學(xué)成分的初步研究[5-6]，為進(jìn)一步明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，從而為紅毛七的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)，本文繼續(xù)對(duì)其70%乙醇提取物的正丁醇萃取部位進(jìn)行化學(xué)成分研究，共分離得到5個(gè)三萜皂苷1～5（見(jiàn)圖1），其中，化合物1為新化合物，且首次在紅毛七屬植物中發(fā)現(xiàn)羽扇豆烷型三萜皂苷，化合物5為首次從該屬植物中分離得到。

圖1 皂苷1～5的結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structure of saponins 1～5

1 材料

PL343 旋光儀（Perkin-Elmer公司）；Quatrro Micro質(zhì)譜儀（Micromass公司）；Bruker AVANCE 500 型核磁共振波譜儀（Bruker公司）；戴安P680高效液相色譜儀（P680系列單泵、UV-VS 檢測(cè)器、CHROMELON工作站）[配YMC-Pack R&D ODS-A半制備色譜柱（20 mm×250 mm，5 μm）]；Agilent GC-6820氣相色譜儀[配HP-5 彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），氫火焰離子化檢測(cè)器]；ODS C18柱（Merck公司）；Sephadex LH-20凝膠（GE公司）；柱色譜硅膠（100～200目、200～300目）、薄層色譜用硅膠H、預(yù)制硅膠板G（青島海洋化工廠）；RP-18高效薄層預(yù)制板（Merck公司）。色譜純甲醇（天津科密歐公司）；氘代試劑（Merck公司）；對(duì)照品L-阿拉伯糖、D-半乳糖、L-鼠李糖和D-葡萄糖（Sigma公司）；顯色劑（20%硫酸/乙醇溶液）；其他試劑均為分析純。

藥材于2014年8月采自陜西省太白山，經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系中藥與天然藥物學(xué)教研室湯海峰教授鑒定為類(lèi)葉牡丹（Caulophyllum robustumMaxim.）的根及根莖，藥材標(biāo)本（No.20140918）保存于該教研室標(biāo)本室。

2 提取與分離

取干燥粉碎的藥材5 kg用70%乙醇回流提取3次，每次2 h，減壓回收溶劑得浸膏413.2 g。將浸膏加水5 L分散后用等體積石油醚萃取2次，再用等體積正丁醇萃取3次，減壓回收正丁醇層得浸膏202.6 g。取正丁醇浸膏130 g用硅膠柱色譜分離，用V三氯甲烷：V甲醇：V水（50∶1∶0～63∶35∶0.5）梯度洗脫，合并得到7個(gè)部分（Fr.1～Fr.7）。Fr.1（5.11 g）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜（洗脫劑為甲醇）除去雜質(zhì)，再經(jīng)ODS C18柱 色 譜，V甲醇：V水（3∶7～10∶0）梯度洗脫，得到化合物2（19.8 mg）。Fr.6（14.77 g）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜（洗脫劑為V三氯甲烷：V甲醇＝1∶1）除去雜質(zhì)，再經(jīng)ODS C18柱色譜分離，V甲醇：V水（1∶1～7∶3）梯度洗脫，合并得到3個(gè)組分（Fr.6-1～Fr.6-3）。Fr.6-2（440 mg）經(jīng)過(guò)半制備HPLC分離純化（流速8 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)206 nm），65%甲醇洗脫得到化合物4（157.9 mg，tR＝6.5 min）。Fr.6-3（700 mg）經(jīng)半制備HPLC反復(fù)分離純化（流速3 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)206 nm），70%甲醇洗脫得到化合物1（11.9 mg，tR＝32.9 min）、化合物3（28.3 mg，tR＝22.4 min）和化合物5（169.8 mg，tR＝40.6 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無(wú)定形粉末，[α]D22－23.2°（c0.1，MeOH），Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)均呈陽(yáng)性，提示該化合物可能為皂苷類(lèi)。IR（KBr）νmaxcm－1：3400（OH），2930（CH），1725（C＝O）。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z1243 [M＋Na]＋（正離子模式）和1219 [MH]－（負(fù)離子模式）；從HR-ESI-MS的準(zhǔn)分子離子峰m/z1219.6081 [M－H]－（C59H95O26，計(jì)算值為1219.6112），結(jié)合NMR數(shù)據(jù)，可推斷出其分子式為C59H96O26。化合物1的1D NMR數(shù)據(jù)顯示δH0.86（H3-24），0.90（H3-26），0.98（H3-25），1.02（H3-27），1.06（H3-23）和1.71（H3-30）處的6個(gè)甲基單峰信號(hào)，δH4.63和4.76處的2個(gè)寬單峰烯質(zhì)子信號(hào)以及δC151.9（C-20）和110.6（C-29）處的一對(duì)特征的烯碳信號(hào)，以及δC176.4（C-28）處的酯羰基碳信號(hào)，表明化合物1的苷元具有羽扇豆-20（29）-烯-28-酸的骨架。δH3.15（dd，J＝12.0，4.5 Hz）處的連氧次甲基信號(hào)歸屬為H-3，NOESY譜中H-3和H-5（δH0.76，br d，J＝11.5 Hz）的NOE相關(guān)表明H-3為α構(gòu)型。通過(guò)2D NMR（1H-1H COSY、TOCSY、HSQC、HMBC和NOESY）分析歸屬了苷元部分的碳?xì)湫盘?hào)，見(jiàn)表1。與白樺酸的核磁數(shù)據(jù)（CDCl3或C5D5N）[7-9]對(duì)照，排除溶劑不同（CD3OD）的影響，結(jié)果基本一致，從而確定化合物1的苷元為3β-羥基-羽扇豆-20（29）-烯-28-酸，即白樺酸（樺木酸）。化合物1的C-28和C-3的化學(xué)位移值分別比白樺酸[7]位移了－4.1和＋12.4，表明其為3和28位連糖的雙糖鏈皂苷。化合物1用2 mol·L－1三氟乙酸水解，按文獻(xiàn)方法[8，10]將所得單糖制備三甲基硅醚化L-半胱氨酸衍生物，以標(biāo)準(zhǔn)糖衍生物作對(duì)照，進(jìn)行GC分析，表明化合物1的糖基為D-葡萄糖（Glc）、L-鼠李糖（Rha）和L-阿拉伯糖（Ara），組成比為3∶1∶1。在1H-NMR譜中顯示5個(gè)糖基的端基氫信號(hào)δH4.52（d，J＝6.0 Hz，Ara），4.60（d，J＝7.5 Hz，GlcⅢ），5.49（d，J＝8.5 Hz，Glc Ⅰ），4.40（d，J＝8.0 Hz，GlcⅡ）和4.86（s，Rha），在HMQC譜 中 分 別與相應(yīng)的糖端基碳信號(hào)相關(guān)（δC105.5，104.9，95.4，104.7和103.1）。由GlcⅠ、GlcⅡ和GlcⅢ的端基氫偶合常數(shù)可知3個(gè)葡萄糖形成的苷鍵均為β構(gòu)型；在NOESY譜中阿拉伯糖的H-1和H-3、H-1和H-5存在NOE相關(guān)（4C1式），可推知其形成的苷鍵為α構(gòu)型，盡管其端基氫偶合常數(shù)（6.0 Hz）小于甲基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷（8.0 Hz），這可解釋為4C1和1C4式的快速構(gòu)象平衡[11]；鼠李糖的端基氫信號(hào)為單峰，根據(jù)其C-5的化學(xué)位移值（δC70.8）可知其形成的苷鍵為α構(gòu)型[12]。通過(guò)對(duì)2D NMR解析，歸屬了5個(gè)糖基的碳?xì)湫盘?hào)（見(jiàn)表1）。通過(guò)HMBC和NOESY分析可確定糖基的連接位置和連接順序（見(jiàn)圖2）。在HMBC譜中，Ara H-1與苷元C-3存在遠(yuǎn)程相關(guān)峰，說(shuō)明Ara連接于苷元C-3位；Glc Ⅲ H-1與Ara C-2的遠(yuǎn)程相關(guān)表明Glc Ⅲ連接于Ara的C-2位；同樣，Glc Ⅰ H-1/C-28、GlcⅡ H-1/GlcⅠ C-6和Rha H-1/Glc Ⅱ C-4的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)可以確定28位糖鏈的結(jié)構(gòu)。NOESY譜的相關(guān)信號(hào)進(jìn)一步驗(yàn)證了上述糖鏈結(jié)構(gòu)。綜上所述，確定化合物 1 的結(jié)構(gòu)為3-O-β-D-吡喃葡萄糖-（1→2）-α-L-吡喃阿拉伯糖-白樺酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-（1→4）-β-D-吡喃葡萄糖-（1→6）-β-D-吡喃葡萄糖苷，經(jīng)SciFinder檢索為新化合物。

表1 化合物1的1H-NMR (500 MHz)和13C-NMR (125 MHz)數(shù)據(jù)(in CD3OD) Tab 1 1H-NMR (500 MHz) and 13C-NMR (125 MHz) data of compound 1 in CD3OD

圖2 化合物1重要的HMBC和NOESY相關(guān)Fig 2 Key HMBC and NOESY correlations of compound 1

化合物2：白色無(wú)定形粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)均呈陽(yáng)性。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z789 [M＋Na]＋（正離子模式）和765 [M－H]－（負(fù)離子模式），提示其相對(duì)分子質(zhì)量為766，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C41H66O13。在化合物2的1H-NMR譜高場(chǎng)區(qū)δH0.90，0.90，0.94，0.98，1.15和1.20處可見(jiàn)歸屬于苷元部分的6個(gè)甲基單峰信號(hào)，在δH5.45處可見(jiàn)一個(gè)烯氫寬單峰信號(hào)；此外，還可觀察到δH3.12（dd，J＝13.5，4.0 Hz，H-3）和3.28（dd，J＝11.5，4.5 Hz，H-18）等信號(hào)。在化合物2的13C-NMR譜中，可見(jiàn)一對(duì)烯碳信號(hào)分別位于δC123.5和144.1，一個(gè)酯糖基碳信號(hào)δC177.0，一個(gè)氧取代亞甲基碳信號(hào)δC65.0和一個(gè)氧取代次甲基碳信號(hào)δC82.4。這些是齊墩果烷型三萜常春藤皂苷元的特征信號(hào)，而且在苷元的3位和28位均與糖基成苷。化合物2苷元部分的碳譜信號(hào)（見(jiàn)表2）與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]，從而確認(rèn)了苷元的結(jié)構(gòu)。按與化合物1相同的方法，對(duì)化合物2進(jìn)行酸水解及衍生，經(jīng)GC分析表明其糖基為L(zhǎng)-Ara和D-Glc（1∶1）。NMR譜中顯示兩個(gè)糖的端基氫和端基碳信號(hào)[δH6.24（d，J＝7.9 Hz，GlcⅠ H-1），4.99（d，J＝7.0 Hz，Ara H-1）；δC96.3（GlcⅠ C-1），107.2（Ara C-1）]，根據(jù)苷化位移規(guī)律，可推斷阿拉伯糖與苷元的3位連接，葡萄糖與苷元的28位羧基成酯苷。因此，確定化合物2的結(jié)構(gòu)為3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，即已知化合物HN-saponin F，波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。

化合物3：白色無(wú)定形粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)均呈陽(yáng)性。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z1097 [M＋Na]＋（正離子模式）和1073 [M－H]－（負(fù)離子模式），提示其相對(duì)分子質(zhì)量為1074，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C53H86O22。通過(guò)與化合物2對(duì)照，發(fā)現(xiàn)兩者苷元部分的碳譜數(shù)據(jù)一致，確定化合物3的苷元亦為常春藤皂苷元，且在苷元3位和28位均與糖連接成苷。化合物3的13C-NMR譜中，比化合物2多出一組六碳糖信號(hào)和一組甲基五碳糖信號(hào)，因苷元3位阿拉伯糖的碳化學(xué)位移無(wú)變化，這兩個(gè)糖應(yīng)該屬于苷元28位的糖鏈。按與化合物1相同的方法，對(duì)化合物3進(jìn)行酸水解及衍生，經(jīng)GC分析表明其糖基為D-Glc、L-Ara和L-Rha（2∶1∶1）。通過(guò)2D NMR分析歸屬了化合物3的所有碳?xì)湫盘?hào)，重要的1H-NMR（500 MHz，C5D5N）信號(hào)如下：δH0.85，0.86，0.93，0.97，1.11，1.16（each 3H，s），1.71（3H，d，J＝6.1 Hz，Rha H-6），3.06（dd，J＝13.5，4.0 Hz，H-3），3.14（1H，dd，J＝3.5，13.5 Hz，H-18），4.92（1H，d，J＝7.3 Hz，Ara H-1），4.94（1H，d，J＝8.0 Hz，Glc Ⅱ H-1），5.38（1H，br s，H-12），6.23（1H，d，J＝8.2 Hz，GlcⅠ H-1），6.39（1H，s，Rha H-1）；13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。根據(jù)HMBC譜分析確定了28位糖鏈的結(jié)構(gòu)，與化合物1的28位糖鏈相同。通過(guò)與文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)照[14]，確定化合物3的結(jié)構(gòu)為3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-（1→4）-β-D-吡喃葡萄糖-（1→6）-β-D-吡喃葡萄糖苷，即已知化合物紅毛七皂苷D，兩者波譜數(shù)據(jù)一致。

化合物4：白色無(wú)定形粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)均呈陽(yáng)性。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z1243 [M＋Na]＋（正離子模式）和1219 [M－H]－（負(fù)離子模式），提示其相對(duì)分子質(zhì)量為1220，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C59H96O26。通過(guò)與化合物3對(duì)照，發(fā)現(xiàn)化合物4的13C-NMR譜中少了一個(gè)連氧亞甲基碳信號(hào)，多了一個(gè)甲基碳信號(hào)δC29.4（C-23），并因此造成鄰近碳的化學(xué)位移變化（C-3、C-4、C-5、C-24等），表明化合物4的苷元為齊墩果酸，且同樣為雙糖鏈皂苷；經(jīng)與以齊墩果酸為苷元的皂苷的波譜數(shù)據(jù)對(duì)照[9]，可確認(rèn)化合物4的苷元結(jié)構(gòu)。化合物4的13C-NMR譜中，比化合物3多出一組六碳糖信號(hào)，根據(jù)Ara C-2的化學(xué)位移變化（δC82.3），提示該糖基連接于Ara的C-2位。按與化合物1相同的方法，對(duì)化合物4進(jìn)行酸水解及衍生，經(jīng)GC分析表明其糖基為D-Glc、L-Ara和L-Rha（3∶1∶1）。通過(guò)2D NMR分析歸屬了化合物4的所有碳?xì)湫盘?hào)，重要的1H-NMR（500 MHz，C5D5N）信號(hào)如下：δH0.88，0.89，0.90，1.02，1.05，1.10，1.22，1.23（each 3H，s），1.70（3H，d，J＝6.2 Hz，Rha H-6），3.19（1H，overlapped，H-3），3.19（1H，overlapped，H-18），4.91（1H，d，J＝5.7 Hz，Ara H-1），4.96（1H，d，J＝7.8 Hz，Glc Ⅱ H-1），5.18（1H，d，J＝8.0 Hz，Glc Ⅲ H-1），5.36（1H，br s，H-12），6.23（1H，d，J＝8.2 Hz，GlcⅠ H-1），6.28（1H，s，Rha H-1）；13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。根據(jù)HMBC譜分析確定了3位和28位糖鏈的結(jié)構(gòu)，與化合物1的糖鏈相同。因此，確定了化合物4的結(jié)構(gòu)，即已知化合物3-O-β-D-吡喃葡萄糖-（1→2）-α-L-吡喃阿拉伯糖-齊墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-（1→4）-β-D-吡喃葡萄糖-（1→6）-β-D-吡喃葡萄糖苷，波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]。

化合物5：白色無(wú)定形粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)均呈陽(yáng)性。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z1243 [M＋Na]＋（正離子模式）和1219 [M－H]－（負(fù)離子模式），提示其相對(duì)分子質(zhì)量為1220，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C59H96O26，與化合物4相同。通過(guò)與化合物4對(duì)照，發(fā)現(xiàn)兩者苷元部分的碳譜數(shù)據(jù)一致，確定化合物5的苷元亦為齊墩果酸，且同樣為雙糖鏈皂苷。按與化合物1相同的方法，對(duì)化合物5進(jìn)行酸水解及衍生，經(jīng)GC分析表明其糖基為D-Glc、L-Ara、L-Rha和D-半乳糖（D-Gal），組成比為2∶1∶1∶1。通過(guò)2D NMR分析歸屬了化合物5的所有碳?xì)湫盘?hào)，重要的1H-NMR（500 MHz，C5D5N-D2O＝3∶1）信號(hào)如下：δH0.81，0.83，0.84，0.99，1.03，1.16，1.19（each 3H，s），1.64（3H，d，J＝6.1 Hz，Rha H-6），3.09（1H，br d，J＝13.1 Hz，H-18），3.18（1H，dd，J＝11.2，5.0 Hz，H-3），4.88（1H，d，J＝6.2 Hz，Ara H-1），4.92（1H，d，J＝7.6 Hz，Gal H-1），5.12（1H，d，J＝7.8 Hz，Glc Ⅲ H-1），5.37（1H，br s，H-12），5.68（1H，s，Rha H-1），6.14（1H，d，J＝8.2 Hz，GlcⅠ H-1）；13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。根據(jù)HMBC譜分析，可確定苷元3位和28位的糖鏈分別為Rha（1→4）[Glc（1→2）]Ara-和Gal（1→6）Glc-。通過(guò)與文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)照[16]，確定化合物5的結(jié)構(gòu)為3-O-β-D-吡喃葡萄糖-（1→2）-[α-L-吡喃鼠李糖-（1→4）]-α-L-吡喃阿拉伯糖-齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃半乳糖-（1→6）-β-D-吡喃葡萄糖苷，即已知化合物arboreaside D，兩者波譜數(shù)據(jù)一致。化合物5為首次從紅毛七屬植物中得到。

表2 化合物2～5的13C-NMR數(shù)據(jù)(125 MHz，2～4 in C5D5N，5 in C5D5N-D2O＝3∶1) Tab 2 13C-NMR data of compounds 2～5 (125 MHz，2～4 in C5D5N，5 in C5D5N-D2O＝3∶1)

續(xù)表2

4 結(jié)果與討論

類(lèi)葉牡丹在全國(guó)分布較為廣泛，其中，陜產(chǎn)紅毛七作為重要的陜西七藥（太白七藥）之一，在陜西民間應(yīng)用甚廣，但有關(guān)其皂苷成分的報(bào)道并不多（進(jìn)行皂苷成分研究的藥材多來(lái)自黑龍江）。本課題組前期研究表明，陜產(chǎn)紅毛七總皂苷有良好的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。為了從中發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性化合物，本研究對(duì)其皂苷類(lèi)成分進(jìn)行了較為系統(tǒng)的分離鑒定，共報(bào)道5個(gè)皂苷成分，包括4個(gè)已知化合物（其中1個(gè)為首次從紅毛七屬植物中發(fā)現(xiàn)）和1個(gè)新化合物。新化合物為羽扇豆烷型三萜皂苷，而目前從紅毛七中發(fā)現(xiàn)的50余個(gè)三萜皂苷其苷元均為齊墩果烷型，這是否可證明不同產(chǎn)地的紅毛七存在成分的差異，值得進(jìn)一步探討。在研究中發(fā)現(xiàn)，陜產(chǎn)紅毛七含有種類(lèi)豐富的皂苷成分，可能還存在一些新化合物，將進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行更深入的化學(xué)和藥理活性研究，為其開(kāi)發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。