中藥一致性評價關鍵技術
——中藥溶出-系統指紋定量法 評價溶出曲線相似性

張凡，楊婷，蘭麗麗，張沁怡，遲晗笑，孫萬陽，孫國祥，*（.沈陽藥科大學藥學院，沈陽 006；.藥都（本溪）一致科技有限公司，遼寧 本溪 7004；3.暨南大學藥學院，廣州 5063）

溶出度是指活性藥物從片劑、膠囊劑或顆粒劑等普通制劑在規定條件下的溶出速率和程度[1]。固體制劑只有溶出才能被機體吸收，所以溶出度能反映藥物在體內的吸收和利用，是評價藥物工藝的重要指標。藥物溶出曲線評價方法主要有差異因子（f1）法、相似因子（f2）法、溶出模型依賴法、Kalman濾波法、組分權重系數法和自身對照法等[2-3]。根據《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》及相關文獻[4-9]，多采用f2法對中藥固體制劑中單一組分或多組分進行溶出度測定，但是中藥成分復雜多樣，多組分協同發揮作用，測定單一或數個指標成分溶出行為不能充分體現制劑整體藥效成分的溶出特性。在中藥質量控制中應體現“整體觀”，而f2法對差異限度要求過高，有1～2點相差10%則導致f2不合格。f2無溶出總量差異的簡捷描述，因此不適合中藥固體制劑溶出度評價。鑒于此，本文提出中藥溶出-系統指紋定量法用于溶出曲線評價。 復方甘草片是常用鎮咳祛痰藥，收錄于2020年版《中國藥典》，其質量按照化學藥控制方法對嗎啡和甘草酸含量進行測定，無溶出度測定[10]。主要成分為甘草浸膏粉112.5 mg、罌粟果提取物粉4 mg、八角茴香油2 mg、樟腦2 mg和苯甲酸鈉2 mg，這5種原料質量約占片重的90%。中藥提取物成分約占片重的88%，因此復方甘草片實質是中藥復方制劑，但因含嗎啡和磷酸可待因等麻醉物質而被列入麻醉品管控，按化學藥質量控制管理。2016年它被列入一致性評價289目錄第97號，為國內特有品種，有36個藥廠生產。孫國祥教授參與主持該藥一致性評價時，鑒于中藥固體制劑溶出曲線無統一的、被廣泛認可的評價方法，從中藥特殊性出發對11個廠家共39批復方甘草片紫外全指紋溶出曲線用Sm和Pm評價并與f2對比，找到了中藥溶出曲線一致性評價的新方法。

1 中藥溶出-系統指紋定量法原理

中藥系統指紋定量法廣泛用于HPLC指紋圖譜評價和紫外全指紋溶出度法的累計溶出度計算，本文首次將其用于中藥溶出曲線相似性評價。

1.1 中藥溶出-系統指紋定量法[11-13]

把中藥供試制劑溶出曲線各點溶出度值按時間順序排列定義為供試溶出指紋向量，＝（x1，x2，…，xn），把參比制劑溶出曲線各溶出度值按時間順序排列定義為參比溶出指紋向量，＝（y1，y2，…，yn），則與之間的夾角余弦即為定性相似度SF，但其受溶出度大值影響。為消除其影響，將作＝（1，1，…，1），作＝（x1/y1，x2/y2，…，xn/yn），則和之間的夾角余弦即比率定性相似度SF'，將SF與SF'的均值Sm稱為溶出-宏定性相似度，見式（1）；用其整體監測供試溶出曲線指紋大小分布比例與參比制劑溶出曲線指紋大小分布比例的相似程度，一般Sm≥0.90時供試制劑溶出曲線與參比溶出曲線很相似。投影含量相似度C用來揭示兩制劑溶出曲線對應指紋溶出度的投影含量相似程度（大溶出指紋權重大，掩蔽小指紋），定量相似度P是宏觀含量相似度R經SF校正所得（大小指紋等權且消除溶出度大小交疊效應），將C和P的均值Pm稱為溶出-宏定量相似度，用來表征兩制劑溶出曲線中全部對應指紋總量百分比，就是供試制劑溶出曲線下面積相當于參比制劑溶出曲線下面積百分比，是以參比制劑溶出曲線面積為標準來定量描述供試制劑溶出曲線下面積百分數，見式（2）。利用溶出-宏定性相似度和溶出-宏定量相似度來定性定量評價溶出曲線相似性方法，稱為溶出-系統指紋定量法，見圖1，據此將藥物溶出曲線相似性劃分為8級，見表1。

表1 中藥溶出-系統指紋定量法劃分中藥溶出曲線相似性標準 Tab 1 Similarity grades standard of TCM dissolution curve divided by DSQFM

圖1 三種類型中藥溶出定量指紋曲線Fig 1 Three types of quantitative fingerprint dissolution curves of TCM

1.2 f2因子評價法[14-16]

f2因子是一種簡單的非模型依賴方法，是用來評價相同溶出條件下受試與參比制劑溶出曲線相似性。f2越接近100，則兩條曲線越完全一致；f2大于50，認為兩條曲線相似。根據公式（3）計算f2，其中Rt與Tt分別代表參比和受試制劑第t時間點的平均累積釋放度，n為測試點數。f2會放大Rt與Tt差異值，其數值和溶出量對應差異不夠簡單明確。一般受試制劑溶出曲線指紋與參比制劑溶出曲線指紋相似度滿足①Sm≥0.9和② 90%≤Pm≤110%時則f2大于50。但對中藥復雜體系要適當放寬標準，滿足①Sm≥0.9和② 70%≤Pm≤130%即認為受試制劑溶出曲線相似性合格，此時f2可能會低于50，但不影響中藥溶出-系統指紋定量法對溶出曲線相似性的定量判斷。

1.3 中藥紫外全指紋溶出度測定法[13，17-21]

中藥紫外光譜突出反映中藥主組分化學物質對紫外光的吸收信息，由不飽和雙鍵、三鍵、長共軛體系結構及少量特殊飽和鍵產生（由π→π*，n→π*，n→σ*躍遷產生）。中藥紫外全指紋溶出度測定采用HPLC-DAD法，以空心PEEK管代替色譜柱測定樣品的非分離色譜圖（所有組分在同一色譜峰內），通過記錄中藥全部混合主組分化學指紋的在線紫外光譜來獲得整體化學物質在190～400 nm紫外光譜指紋圖譜。有兩種測定方法：① 2 h溶出標準譜法：以2 h點作為全溶出紫外標準指紋圖譜來定量測定其他取樣點的溶出度，這種方法會出現2 h組分存在未全溶出情況；② 全溶出標準譜法：取本品10片，精密稱定，研細，精密稱取細粉適量（約相當于1片重），置900 mL溶出介質中，超聲10～30 min至完全溶解（時間通過預試驗測定），測定該溶出點為全溶出紫外標準圖譜來定量測定其他取樣點紫外指紋的溶出度（裝置圖見圖2）。第二種方法由于采用非樣品溶出環境常會導致組分過度溶出，因此對于不同廠家同一種制劑和不同批次采用第2種方法評價為佳。此兩種方法均監控190～400 nm紫外光譜的221個紫外波長下的指紋點，采用中藥系統指紋定量法計算，實際仍然使用公式1～2。用【中藥主組分一致性數字化評價系統2.0】軟件（帶審計追蹤）計算溶出紫外指紋譜的Sm和Pm，以Pm計算累積溶出度（溶出介質900 mL，每次取樣2.5 mL，補液體積為2.5 mL），按公式（4）計算；不補液時按公式（5）計算。

圖2 紫外全波段（190～400 nm）監測中藥全化學指紋成分的溶出度裝置圖Fig 2 Dissolution apparatus for monitoring the overall chemical fingerprints of TCM components with UV full-band（190～400 nm）

復方甘草片質量一致性評價中有12個藥廠采用紫外全指紋溶出度測定法評價復方甘草片體外溶出度差異。經過多年應用試驗證明該法能有效區分復方甘草片工藝中存在的問題，為復方甘草片制劑工藝一致性控制提供了有效監測方法[13]。但是文獻[13]仍使用f2評價溶出曲線，本文使用中藥溶出-系統指紋定量法評價溶出曲線相似性。紫外全指紋溶出度測定法和中藥溶出-系統指紋定量法是使用同一套計算公式，只是前者是計算各溶出取樣點的溶出度，后者是對整條溶出曲線計算供試制劑與參比制劑間的兩條溶出曲線相似性。

2 儀器與試藥

Agilent 科技有限公司Agilent 1100型液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器、四元梯度泵、在線脫氣機、自 動 進 樣 器）、Agilent OpenLAB CDS Chemstation（Edition C.01.07）網絡工作站、ZRS-8G溶出度測定儀（天津新天光分析儀器技術有限公司）、ESE120BⅡ電子分析天平（天津市德安特傳感技術有限公司）、JP-040S超聲波清洗器（深圳市潔盟清洗設備有限公司）。磷酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）、鹽酸（色譜純，天津市凱信化學工業有限公司）、乙腈（色譜純，山東禹王實業有限公司化工分公司）、純凈水（沈陽娃哈哈啟力食品有限公司）。復方甘草片共39批，由廠家A（S1～S3）、B（S4～S6）、C（S7～S9）、D（S10～S12）、E（S13～S15）、F（S16～S20）、G（S21～S23）、H（S24～S26）、I（S27～S29）、J（S30～S34）、K（S35～S39）生產。

3 方法

3.1 色譜條件

聚醚醚酮空心管替換色譜柱（PEEK Tube，5000 mm×0.18 mm）；柱溫：35.0℃；流動相：乙 腈-水-磷 酸（40∶60∶0.2）；流 速：0.7 mL·min－1；進樣量：5 μL；檢測波長：190～ 400 nm（DAD）。

3.2 紫外全指紋溶出度測定時不同點取樣溶液

3.2.1 溶出介質為pH 1.0鹽酸溶液 采用槳法測定樣品溶出度。取同一廠家同一批號樣品6片分別投入溶出杯中，pH 1.0鹽酸（精密量取鹽酸9 mL，用水稀釋至1000 mL，搖勻，即得）。體積為900 mL，溫度為37℃，轉速50 r·min－1，溶出時間取樣點分別為5、30、60、90、120、180、240、300 min，取樣體積為2.5 mL，儀器自動取液并補充相同體積及溫度的溶出介質。

3.2.2 溶出介質為純化水 采用槳法測定樣品溶出度。取同一批樣品6片分別投入溶出杯中，溶出介質體積為900 mL，溫度為37℃，轉速50 r·min－1，溶出取樣時間點分別為5、15、30、45、60、90、120 min，取樣體積2.5 mL，儀器自動取液并補充相同體積及溫度的溶出介質。

3.2.3 全溶出溶液制備 取復方甘草片（S1）10片，精密稱定，研細，精密稱取1片量，置于900 mL的溶出介質（純化水）中，超聲15 min至完全溶解，搖勻，用0.45 μm水系微孔濾膜濾過，即得。

3.3 紫外全指紋溶出度測定法

每個企業取3～5批不同批復方甘草片，每批6片，制備供試品溶液，進樣檢測。將測得非分離色譜圖導出在線紫外光譜*.csv文件，再導入【中藥主組分一致性數字化評價系統2.0】軟件（帶審計追蹤），分別以全溶出點或120 min、300 min紫外指紋圖譜做標準計算各點溶出液的Pm，其中Pasi即為各時間點相對累積溶出度。

4 結果與討論

4.1 方法學驗證

4.1.1 精密度試驗 取全溶出供試品溶液適量，連續測定6次，按平均值法生成紫外對照指紋圖譜，結果平均Sm＝1.00（RSD＝0.0%）；平均Pm＝100.0%（RSD＝0.7%），結果表明儀器精密度良好。

4.1.2 穩定性試驗 取全溶出供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24 h后進樣測定，以0時測定的紫外指紋圖譜為標準，評價其他5次測定紫外指紋圖譜，結果Sm、Pm的RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

4.1.3 重復性試驗 取廠家A樣品（S1），平行制備供試品溶液6份，再進樣測定，按平均值法生成紫外對照指紋圖譜，結果Sm、Pm的RSD均小于2.0%，表明方法重復性良好。

4.2 不同溶出介質中溶出情況比較

以不同時間相對累積溶出度為縱坐標，溶出時間為橫坐標繪制累積溶出曲線，不同企業樣品在水和pH 1.0鹽酸溶液中的溶出曲線見圖3。

圖3 復方甘草片在水介質和 pH 1.0鹽酸介質中的溶出曲線Fig 3 Dissolution curve of compound liquorice tablet in water and HCl（pH 1.0）

4.3 用兩種方法評價同一廠家批內溶出曲線相似性

同一廠家內，選擇各廠家溶出曲線均值為參比，分別采用f2法和中藥溶出-系統指紋定量法，對同一廠家內不同批次的樣品進行溶出曲線相似性比較。以最末點為標準，在水介質和pH 1.0鹽酸介質中39批復方甘草片批內除S33（pH 1.0鹽酸為介質時f2＝43）外其他38批復方甘草片的溶出曲線相似性都合格（f2都＞50）。以全溶出為標準，S2、S20和S27等3批制劑在水介質中溶出曲線相似性不合格（f2＜50）。以全溶出為標準時，在pH 1.0鹽酸介質中有13批復方甘草片（S16、S18～19、S22、S25～26、S28～29、S31～36）批內溶出曲線相似性都不合格（f2均＜50），總計有16批結果的f2不合格，見表2。把39批復方甘草片的f2作為縱坐標，Pm作為橫坐標作圖（見圖4A），圖中底部方框內按照中藥溶出-系統指紋定量法只要滿足①Sm≥0.9和② 70%≤Pm≤130%即可認為中藥溶出度合格，這個標準會把部分f2值低的制劑的溶出曲線納入合格范圍，比如上述16個不合格的f2對應復方甘草片溶出曲線按新方法評價只有3個數據（S26、S29和S33）逸出。當溶出曲線滿足①Sm≥0.9和② 90%≤Pm≤110%時f2值都＞50，因此中藥溶出-系統指紋定量法規定在以上標準范圍內其評價結果與f2評價結果完全一致。

圖4 復方甘草片批內（A）及批間（B）溶出曲線一致性評價時f2與溶出-宏定量相似度關系Fig 4 Quality consistency of compound liquorice tablet dissolution curves intro （A）or inter（B）different batches of f2 versus dissolution-macro quantitative similarity

表2 在兩種不同介質中用溶出-系統指紋定量法和f2法評價11廠家批內溶出曲線相似性 Tab 2 Similarity of dissolution curve of 11 manufacturers in two media (DSQFM and f2)

4.4 用兩種方法評價廠家之間的溶出曲線相似性

4.4.1 選擇廠家A為參比制劑評價溶出曲線相似性 不同廠家之間溶出曲線評價時，首先選擇廠家A為參比制劑，其余生產企業的復方甘草片作為受試制劑，分別采用f2法和溶出系統指紋定量法評價。對生產工藝不同和輔料不盡相同的11家企業進行溶出曲線相似性評價結果見表3。結果對于不同廠家溶出曲線，兩種評價方法結果差異較大：例如廠家D在以末點為標準，溶出介質為水時選擇廠家A為參比制劑，f2＜50為不合格。用Sm＞0.90和Pm＝118.4%，廠家D制劑相當于廠家A制劑118.4%，用新方法制訂的標準評價是合格的，新方法優點在于明確給出了被評制劑溶出度相當于參比制劑溶出曲線的具體百分值。若f2＜50，新給出Pm可判斷供試制劑溶出總量，對于指導提高工藝具有明確判定指標值。根據中藥特殊性把Pm＞70%認為是合格。用Sm和Pm評價溶出曲線時選擇不同溶出介質和不同參比制劑時，評價結果顯著不同。這可清晰反映不同廠家生產的復方甘草片的體外溶出差別，說明其工藝存在差異。選擇廠家A為參比制劑只有廠家H的溶出曲線相似性合格，其他均不相似。當以全溶出為標準時只有在水中廠家H的溶出曲線與A相似性合格。

表3 以廠家A為參比制劑評價11個廠家間復方甘草片溶出曲線相似性結果 Tab 3 Similarity of dissolution curve of compound liquorice tablet from 11 manufacturers evaluated by reference preparation manufacturer A

4.4.2 以11廠家溶出曲線均值為參比評價溶出曲線相似性 選擇11個廠家的均值為標準溶出曲線，分別采用f2法和溶出-系統指紋定量法評價。對生產工藝不同和輔料不盡相同的11家企業進行溶出曲線相似性評價結果見表4。無論采用末點法，還是全溶出為標準，在水介質中廠家C、D、E、F、I、J復方甘草片的溶出曲線f2均大于50。但在pH 1.0的HCl介質中，末點法為標準B、C、D、E、F、H、I、J、K的f2均 大 于50；但以全溶出為標準時，在pH 1.0的HCl介質中A、C、E、F、K的f2均大于50。選擇標準不同則評價結果有差異。把11個廠家的復方甘草片的f2作為縱坐標，溶出-宏定量相似度作為橫坐標作圖（見圖4B），圖中底部三個方框內按照中藥溶出-系統指紋定量法只要滿足①Sm≥0.9和② 70%≤Pm≤130%即可認為中藥溶出度合格，但f2低于50，此時只有10個數據不合格。一般溶出曲線是DG1、DG2時對應f2基本大于50，部分DG3溶出曲線的f2也合格（與制劑溶出規律有關）。通過本文數據可知如果溶出曲線相似度落在DG1和DG2區間則f2基本合格。對于DG3區間需要具體計算。因此溶出系統指紋定量法，當溶出曲線滿足①Sm≥0.9和② 90%≤Pm≤110%時f2大于50，因此對于溶出效果好的制劑可以定在此范圍。如果中藥制劑溶出度較差可以考慮定在DG3。特殊情況可以把溶出標準定在DG5即滿足①Sm≥0.9和② 70%≤Pm≤130%。中藥制劑的溶出曲線相似性標準要根據制劑的復雜程度來確定。

表4 以均值為標準評價11個廠家復方甘草片溶出曲線相似性結果 Tab 4 Similarity of dissolution curve of compound liquorice tablet from 11 manufacturers evaluated by the mean value

5 結論

本文提出中藥溶出曲線相似性評價法——中藥溶出-系統指紋定量法，將溶出曲線相似性等級劃分為8級，通過11個廠家復方甘草片溶出曲線數據，找到f2與溶出-宏定量相似度關系，當溶出曲線滿足①Sm≥0.9和② 90%≤Pm≤110%時f2＞50，因此對溶出效果好的中藥制劑可把標準定在此范圍；如果中藥制劑溶出度較差可考慮定在85%≤Pm≤115%；特殊情況可把溶出標準定為Sm≥0.9和70%≤Pm≤130%。中藥制劑溶出曲線相似性標準要根據制劑復雜程度和制劑工藝來確定。