老年結核病患者外周血中恒定自然殺傷T淋巴細胞的比例、表型及功能狀態▲

朱雄林 馮顯紅 楊 梅 章革民 姚廣冰

(湖北省武漢市新洲區人民醫院1 感染科，2 檢驗科，3 婦產科，武漢市 430400，電子郵箱：4047695@qq.com)

結核病一種是由結核分枝桿菌復合群感染引起的慢性傳染病。近年來，隨著我國步入老齡化社會，老年人群的結核病呈高發趨勢，并具有高復發率、高耐藥性、高死亡率等特征[1]，是臨床防治的重點。有研究顯示，宿主個體免疫狀況的差異會顯著地影響結核病的發生與發展[2]。因此，準確闡明不同結核病人群的各免疫細胞的表達水平及狀態，對臨床診治有著積極意義。

T淋巴細胞的免疫應答是人體抗結核感染的主要機制[3]。恒定自然殺傷T淋巴細胞(invariant natural killer T lymphocytes,iNKT)是一類 CD1d 限制性T淋巴細胞，在結核感染過程中能夠以CD1依賴的方式顯著地抑制結核桿菌的復制，降低肺臟中的結核桿菌載量，在整個免疫應答過程中發揮重要的作用[4]。本研究分析老年結核病患者外周血中iNKT的比例、表型及功能狀態，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年5月至2019年5月武漢市新洲區人民醫院收治的150例結核病患者，納入標準：(1)均符合中華醫學會結核病學分會制定的診斷標準[5]，并經胸部影像學、痰標本涂片抗酸桿菌等檢查確診；(2)均對本研究知情同意。排除標準：(1)合并心肝腎肺等器官功能衰竭者，或嚴重的免疫系統、神經系統等疾病者；(2)合并支氣管結核、陳舊性結核以及其他感染性疾病者；(3)近期使用免疫抑制劑者。根據年齡將結核病患者分為老年結核病組(≥60歲)與非老年結核病組(<60歲)，其中老年結核病組68例，年齡65～75(69.54±7.44)歲，非老年結核病組82例，年齡32～58(48.85±10.28)歲。同時選取80例老年志愿者作為對照組。納入標準：年齡≥60歲；對本研究知情同意。排除標準：存在影響觀察指標的疾病或近期使用免疫抑制劑者；存在結核病以及其他危重疾病者。對照組研究對象年齡60～75(68.05±8.45)歲。3組研究對象的性別、基礎疾病差異均無統計學意義(均P>0.05)，老年結核病組和非老年結核病組的抗結核治療情況差異亦無統計學意義(P>0.05)，見表1。本研究經過武漢市新洲區人民醫院醫學倫理委員會審核批準。

表1 3組研究對象臨床資料的比較[n(%)]

1.2 主要試劑和儀器 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)、RPMI 1640培養基和胎牛血清均購自美國HyClone公司(批號：SH30256.01，SH30027，SV30087.01)；抗人CD3 BV421、抗人CD4 BV510、抗人CD62L藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)-cy7、抗人CD69異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)、別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)標記的人PBS57/CD1d四聚體均購自美國BioLegend公司(批號：563797，562971，562404，560969，564175);抗人γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)FITC、抗人CD白細胞介素4(interleukin 4,IL-4)PE-cy7、抗人CD161 PE、抗人CD122 FITC均購自美國eBioscience公司(批號：11-7311-41,25-7041-82,25-1619,11-1228);α-半乳糖苷神經酰胺(α-galactosylceramide,α-GalCer)購自美國Avanti Polar Lipids公司(批號：860833);淋巴細胞刺激劑氟波醇乙酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)、離子霉素(ionomycin,Iono)、布雷菲德菌素A(brefeldin A，BFA)均購自美國Abcam公司(批號：ab147465，ab120370，ab120299)。FACSCalibur基本型流式細胞儀購自美國BD公司，MCO-175型CO2培養箱購自日本SANYO公司，96孔細胞培養板購自美國Costar公司。

1.3 檢測方法 (1)外周血單個核細胞的制備：分別抽取對照組研究對象，老年結核病組與非老年結核病組患者治療前的外周血5 mL，肝素抗凝，加入等體積的PBS稀釋。取與血樣樣本等量的淋巴分離液加入15 mL離心管中，再將稀釋好的血液加入分離液的上層，室溫下2 000 r/min離心30 min。吸取中間的灰白色淋巴細胞層，移入另一試管內，加入10 mL PBS，室溫下1 000 r/min離心10 min，PBS洗滌2次，棄上清，加入10 mL染色緩沖液重懸細胞，獲得外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，調整細胞數至5×106個/mL，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養2 h。(2)iNKT比例、表型的檢測：取100 μL的PBMC懸液，加入50 μL的染色緩沖液及相應的單克隆抗體染液(抗人CD3 BV421、抗人CD4 BV510、APC標記的人PBS57/CD1d四聚體、抗人CD161 PE、抗人CD62L PE-cy7、抗人 CD122 FITC、抗人CD69 FITC，以上抗體各5 μL)，4℃避光孵育30 min。然后用PBS重懸，室溫下1 500 r/min離心10 min，棄上清，再用PBS重懸沉淀。采用流式細胞儀檢測iNKT占淋巴細胞的比例，以及iNKT表型CD69、CD161、CD62L、CD122的表達情況。(3)iNKT分泌細胞因子的能力分析：取100 μL的PBMC懸液，加入10 μL PMA(1 ∶100)、8μL Iono(1 ∶20)，置于5%CO2培養箱中培養1.5 h 激活細胞，然后加入8 μL BFA(1 ∶10)繼續培養3.5 h。將細胞轉至流式管中，PBS洗滌1次，1 500 r/min離心10 min，50 μL染色緩沖液重懸PBMC后，加入抗人CD3 BV421、抗人CD4 BV510、APC標記的人PBS57/CD1d四聚體以及抗人CD161 PE(以上抗體各5 μL)，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌細胞1次，室溫下1 500 r/min離心10 min，再用200 μL 4%多聚甲醛溶液固定20 min，加入破膜劑1 mL，室溫下1 000 r/min離心10 min，加入50 μL染色緩沖液重懸細胞，加入抗人IFN-γ FITC、抗人CDIL-4PE-cy7各5 μL，4℃避光孵育30 min。PBS洗滌細胞1次，室溫下1 500 r/min離心10 min。加入流式緩沖液重懸細胞，使用流式細胞儀檢測IFN-γ陽性細胞比例和IL-4陽性細胞比例。另取等量PBMC懸液，不加入PMA/Iono刺激，檢測細胞因子表達情況作為各組的陰性對照。(3)iNKT的擴增能力檢測：將100 μL PBMC接種于96孔培養板，加入10 μL α-GalCer(200 ng/mL)，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養7 d。取10 mL細胞懸液，加入50 μL染色緩沖液及相應單克隆抗體染液(抗人CD3 BV421、抗人 CD4 BV510、APC標記的人PBS-57/CD1d四聚體等，以上抗體各5 μL)，4℃避光孵育30 min。加入PBS，室溫下1 500 r/min離心10 min，棄上清，沉淀再用PBS重懸。采用流式細胞儀檢測iNKT被 α-GalCer刺激后的iNKT比例。另取等量PMBC懸液，接種于96孔板，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養液置于37℃、5%CO2培養箱中培養7 d后進行檢測，作為各組空白對照。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。呈正態分布的計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料以例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組研究對象外周血中iNKT占淋巴細胞的比例和表型的比較 3組iNKT占淋巴細胞的比例、CD69表達水平差異均有統計學意義(均P<0.05)，其中老年結核病組的iNKT占淋巴細胞比例低于非老年結核病組及對照組(P<0.05)，老年結核病組和非老年結核病組的CD69表達水平均高于對照組(P<0.05)，但老年結核病組與非老年結核病組的CD69表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；3組的CD161、CD62L、CD122表達水平差異無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 3組研究對象外周血中iNKT占淋巴細胞的比例及其各表型的比較(x±s)

2.2 3組研究對象外周血中iNKT細胞因子分泌能力的比較 3組研究對象在PMA/Iono刺激后iNKT中INF-γ、IL-4分泌陽性細胞率均較刺激前增加(均P<0.05)。但3組在刺激前、刺激后的INF-γ、IL-4分泌陽性細胞率差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表3。

表3 3組研究對象iNKT細胞因子分泌能力的比較(x±s，%)

2.3 3組研究對象外周血中iNKT擴增能力的比較 對照組在α-GalCer刺激后iNKT占淋巴細胞的比例較刺激前增加(P<0.05)；老年結核病組與非老年結核病組在α-GalCer刺激前后的iNKT占淋巴細胞比例差異無統計學意義(均P>0.05)。3組研究對象在α-GalCer刺激后iNKT占淋巴細胞比例差異有統計學意義(P<0.05)，其中老年結核病組與非老年結核病組的iNKT占淋巴細胞比例均低于對照組(均P<0.05)。見表4。

表4 3組研究對象外周血中iNKT擴增能力的比較(x±s，%)

3 討 論

iNKT是一種廣泛分布于外周血中，同時具有自然殺傷細胞和T淋巴細胞部分表型及功能的細胞亞群，能夠發揮免疫調節及抗感染等重要作用。近年來，iNKT在結核病相關的免疫發病機制中的作用受到臨床高度關注[6]。PBMC是機體免疫的重要組成部分，本研究將經過嚴格分離培養獲得的足量PBMC作為檢測標本，并采用CD3+PBS57/CD1d+來分選 iNKT，結果顯示老年結核病患者外周血中iNKT占淋巴細胞的比例低于老年志愿者(P<0.05)，這提示結核感染對老年患者iNKT水平有著較大影響。相關研究結果也表明，感染早期大量結核桿菌的存在會嚴重抑制機體免疫應答，造成部分iNKT的損失[7]。本研究進一步對iNKT進行表面染色，結果顯示老年結核病組CD69表達水平高于對照組(P<0.05)，其余iNKT表型差異無統計學意義(P>0.05)。CD69是T細胞體內活化的標志物，其高水平表達則表明iNKT處于過度活化狀態[8]。近期有學者發現，iNKT活化后Fas與Fas配體表達的上調可促使 iNKT進入次級淋巴組織并發揮 Fas配體介導的殺傷效應，會導致iNKT數量減少[9-10]。由此推測，iNKT活化后凋亡可能也是造成老年結核病患者外周血中iNKT比例下降的主要原因之一。

iNKT可以分泌IFN-γ(Th1型)、IL-4(Th2型)等多種細胞因子，誘導樹突狀細胞的活化和成熟，具有雙向介導保護性和調節性免疫應答的功能[11]。本研究通過PMA/Iono刺激PBMC，采用胞內細胞因子染色法分析iNKT的分泌能力。結果顯示，在PMA/Iono刺激前，老年結核病患者與老年志愿者iNKT細胞中IFN-γ和IL-4分泌陽性細胞率均保持在較低水平，經PMA/Iono刺激后IFN-γ和IL-4分泌陽性細胞率均有明顯提升(均P<0.05)，但刺激前后兩組之間的INF-γ和IL-4分泌陽性細胞率差異并無統計學意義(均P>0.05)，表明在老年結核病患者體內iNKT雖然數量減少并且過度活化，但仍對PMA/Iono反應正常，其分泌細胞因子的潛能并未發生明顯減弱。近期一項針對HBV慢性感染患者的研究結果顯示，感染者外周血中的iNKT經PMA刺激后分泌INF-γ和IL-4的能力與正常對照組無明顯差異，而且發現在HBV感染過程中機體可能通過血清IL-15等細胞因子的負反饋調節機制來維持iNKT部分的細胞因子分泌能力[12]。我們推測，在結核病患者中可能也存在著與之類似的調控機制，這有待后續研究進一步論證。

α-GalCer是iNKT最強的激動劑，其可經由T淋巴細胞受體途徑的非特異性刺激，有效增強CD1d脂類抗原的提呈能力，能夠全面地反映iNKT的真實功能狀態[13]。因此本研究在PBMC中加入α-GalCer后進行檢測，結果顯示在α-GalCer刺激后，老年志愿者iNKT占淋巴細胞的比例較刺激前提升(P<0.05)，而老年結核病組刺激前后的iNKT占淋巴細胞比例差異無統計學意義(P>0.05)，表明老年結核病患者機體中的iNKT對α-GalCer具有低反應性，細胞功能受損嚴重，導致體外擴增效率降低。同時也進一步提示，在結核病iNKT分泌能力保持正常的狀態下，其功能缺陷更可能是由其自身T淋巴細胞受體基因表達受限，導致iNKT無法經α-GalCer刺激在體內正常活化擴增造成[14]。

另外，本研究還比較了不同年齡段結核病患者外周血iNKT的特點，結果顯示老年結核病組iNKT占淋巴細胞的比例低于非老年結核病組(P<0.05)，但兩組患者iNKT的細胞因子分泌能力與擴增能力差異均無統計學意義(均P>0.05)。研究表明，隨著年齡的增長，人體的細胞免疫功能會出現明顯下降，對于結核病患者，這可能會導致機體相關效應細胞對結核桿菌的吞噬作用下降，抗原體提呈功能減弱[15]，使得體內結核桿菌持續存在并維持適度的增殖活性，影響了淋巴細胞的正常表達水平和狀態[16]。因此，老年結核病患者外周血iNKT比例較非老年結核病患者更低。但老年結核病患者病情復雜，受限于本研究樣本量，關于年齡對iNKT細胞的具體影響需要進一步擴大研究分析。

綜上所述，老年結核病患者外周血中iNKT比例下降明顯，并呈過度活化狀態，細胞因子分泌能力正常，但擴增效率降低。