細菌在菌斑形成及致病過程中的相互作用

高哲豐，雷雅燕，孫 宇，李丹薇，和紅兵

（昆明醫科大學附屬口腔醫院牙體牙髓科，云南 昆明 650100）

據文獻報道，細菌及真菌生物膜導致的感染占所有感染的65%，其中包括心內膜炎、牙周炎、中耳炎等疾病[1]。在口腔生物膜中至少生活著700種微生物[2]，它們與齲病、牙周病等口腔疾病都有著密切關系。牙菌斑是一種附著于牙齒表面的微生物生物膜，當生物膜動態平衡出現紊亂時，附著在齦上的牙菌斑可以導致牙齒的脫礦，齲齒的形成[3]，而在牙周袋內的菌斑生物膜和免疫系統的改變則可引起牙槽骨的喪失，牙周病的發生[2]。牙菌斑生物膜具有豐富的細菌多樣性和高度細菌密度的復雜結構，它的形成有助于保護其中的細菌抵抗外界不良因素、促進細菌間的協同作用和形成群體感應系統等，從而使它們具有更高的毒力和環境適應能力。而在生物膜組成細菌的選擇上主要通過“先鋒菌”選擇有利于自身的“合作伙伴”來構建穩定的生態群落[4]。正是由于細菌之間復雜的相互作用，使得同一個體牙齒上相鄰結構的牙菌斑的組成也大不相同[1]。因此，研究生物膜的構成以及細菌間的相互作用有助于了解口腔疾病的發生和發展過程。

1 牙菌斑生物膜的結構及形成過程

牙菌斑生物膜是由鏈球菌、乳酸桿菌、放線菌等微生物與胞外聚合物組成的三維立體結構黏附、定值于牙面[5]，利用激光共聚焦顯微鏡可以觀察到其中包含不均質性的蘑菇樣微生物群落[6]。生物膜內部存在空腔和管道系統，為攝取營養物質和代謝物排放提供條件[5]。菌斑內的細菌是高度結構化的組合，絲狀菌和桿狀菌垂直牙面向外生長，連續排列在斑塊的低端到尖端，而球菌只存在于它們的尖端從而形成玉米棒或者麥穗樣結構，這樣的結構更有利于菌斑的附著和營養物質代謝[7-8]。目前，多位國內外學者應用多重熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技術成功的觀察到牙菌斑生物膜中位于底層和中間層的細菌密度高于頂層，同時由于管道系統分布特點和唾液中抗菌成分的存在，頂層和底層主要以死菌為主，而中間層則以活菌為主[5]。細菌為了抵抗環境變化分泌細胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS），細胞外多糖是其主要成分。作為形成生物膜的關鍵結構，大量的水不溶性多糖構成細菌生長的外環境幫助細菌抵抗外界不利因素，同時所形成的網狀結構可以幫助細菌攝取周圍營養物質，維持新陳代謝[9]，此外它還可以形成多種細菌結構和協助細菌運動[10]。同一種細菌為了適應不同的環境可分泌不同的胞外聚合物。Rabin等[11]發現，銅綠假單胞菌形成生物膜所需藻酸鹽、Pel和Psl這3種胞外多糖，Man-1-P是3種胞外多糖合成的共同的中間介質所以它的生物膜成分將相互影響，當一種成分增多時剩下兩種成分必然減少，同時單藻酸鹽這一種胞外多糖就有24個基因控制著它的合成和分泌，所以胞外聚合物不是一成不變的而是基于參與細菌和環境變化等因素下的動態結構[12]。

在口腔中的細菌為了獲得更高濃度的營養物質、促進自身的遺傳交換和自我保護會選擇附著于牙齒表面。當細菌距離牙齒表面10～20 nm時細菌的氫鍵、疏水作用、靜電相互作用以及鞭毛的動力可以抵消自身所帶電荷的排斥力，當小于5 nm時特定的黏附受體可以增強黏附[13]。最先黏附于牙面的血鏈球菌、變異鏈球菌，戈登鏈球菌等[14-15]，它們可以與獲得性薄膜中的互補受體唾液酸化粘蛋白，富含脯氨酸蛋白，α-淀粉酶，唾液凝集素和細菌細胞片段相結合，形成早期定值于牙面的“先鋒菌”，而那些晚期定值于牙面的細菌種類很大程度取決于這些“先鋒菌”。細菌之間的共聚不同于在遺傳上相同的細胞之間發生的聚集和通過細胞與可溶性分子（例如抗體）的相互作用的細胞凝集，大多數共聚在不同屬的細菌之間發生。在此過程中，鏈球菌表現出廣泛的內部共聚合作用（例如戈登氏鏈球菌和口腔鏈球菌）和種內伙伴關系（例如戈登氏鏈球菌DL1和戈登氏鏈球菌38），每種細菌菌株在伙伴關系中也會表現出特異性，例如一些鏈球菌能夠與某些韋榮球菌共聚，而其他鏈球菌不能與那些韋榮球菌共聚，但與另一組為榮球菌凝聚[11,16]。當然不同屬的細菌在對“棲息地”的選擇上也表現出了特異性，例如變異鏈球菌大多存在于牙齒的咬合面上而血鏈球菌大多存在于牙齒的光滑面上[17]。

當細菌完成了對牙面最初的黏附后，就會通過信號傳導調整細菌的基因表達，以此改變生物膜的生理特征，快速適應周圍環境變化[6]。李雨慶等[18]發現在變異鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌等口腔細菌中都可以發現含有環狀二鳥苷酸GMP（c-di-GMP）合成酶的基因，c-di-GMP作為細菌的第二信使已被證明對多種不同細菌種類中EPS產生的調節具有重要意義[19]。Hengge等[20-22]發現全基因組測序顯示GGDEF和EAL結構域在細菌中普遍存在且具有合成和降解c-di-GMP的能力從而控制感知和響應環境信號并調節表型輸出控制不同細菌物種中的生物膜形成。生物膜的形成也和群體感應系統（quorum sensing，QS）有著緊密的聯系。QS信號分子在結構上具有較低的分子量，包括酰基高絲氨酸內酯（AHL），呋喃糖基硼酸酯二酯（AI-2），順式不飽和脂肪酸（DSF家族信號）和肽[23]。其中自動誘導物（AL-2）是由多種細菌產生的Luxs酶產生的，參與細菌調節和細胞膜的形成[24]。He等[25]發現，構建Luxs過表達的變異鏈球菌和Luxs缺陷的變異鏈球菌與野生的變異鏈球菌分別和嗜酸乳桿菌形成生物膜然后在12 h和24 h進行厚度的比較，發現過表達菌株生物膜明顯增厚且與生物膜相關基因明顯上調而基因缺陷菌株生物膜明顯變薄與生物膜形成相關基因發生下調。

2 細菌在生物膜中基因的轉移

在微生物種類豐富的口腔中，由于牙菌斑生物膜的形成可以提高質粒穩定性和控制宿主范圍，所以可更好調節和發展他們的基因組內容和潛力，使生物膜中基因轉移率明顯高于浮游細胞。細菌間的相互作用通過交換遺傳物質，獲得新的生物學特性[26]，對生物膜的生理和進化具有重要作用。通過多種細菌基因組測序發現，菌斑生物膜中的細菌通過緊密接觸可以促進他們之間的基因交換[11]，此過程稱為基因的水平轉移[27]。水平基因轉移機制包括轉化、綴合和轉導以及最近描述的囊泡介導的基因轉移機制[28]，細胞可以通過直接的接觸、DNA結合質粒或噬菌體感染等方法進行轉移[26]。為了長期存在于細胞基因組中并表達產生表型以建立選擇優勢，受體細胞會通過細胞膜轉運由供體釋放的DNA并使其參與細胞分裂期的復制，對環境變化產生積極反饋，形成對生物有利的表型。同時水平基因轉移機制可以把原本無法整合到生物膜上的基因瞬時轉移到已建立的口腔生物膜的細菌上，使基因來源已經消失的基因任然可以長時間存在于口腔中[28]。實驗證明能夠進行自然遺傳轉化的細菌就有能力從周圍吸收裸露的DNA，感受肽鏈球菌產生溶菌細胞壁水解酶，導致一部分非感受肽鏈球菌溶解并釋放可以被接受的同源基因，為了防止裸露DNA被核酸脫氫酶溶解要求需要細菌之間有非常近的距離才能完成[29-30]。Richards等[31]對鏈球菌基因組的研究發現，最終的基因組受細菌的相關性和環境因素等影響經歷動態擴增和部分缺失演變而來，而這往往是一種瞬態的過程[32]。正是生物膜中細菌之間的選擇性聚集、信號傳導和基因轉移機制促進了細菌生物膜的適應性和多樣性。

3 細菌的相互作用對細菌致病性的影響

牙菌斑生物膜中存在很多具有致病性的細菌，它們比浮游的細菌具有更強的毒力特性，包括定值于牙面形成生物膜、產酸和耐酸能力、毒力因子的進化等[33]。可以通過分析細菌之間大量基因轉移和重組、克隆性選擇和調節性調節，從而對細菌的致病性和相互作用的機制有更好的理解[34]。

3.1 細菌相互作用對致齲性的影響

在復雜的口腔環境中，存在于牙菌斑生物膜中的細菌比浮游狀態的細菌具有更強的粘附力、產酸和耐酸能力，所以牙菌斑生物膜中的細菌擁有更強的致齲性。變異鏈球菌是公認的致齲菌，而白色念珠菌常在口腔黏膜中常被發現，在幼兒齲中發現變異鏈球菌和白色念珠菌之間存在一定的聯系[35]。白色念珠菌不能有效代謝蔗糖，當與變異鏈球菌共培養時就可直接利用變異鏈球菌的代謝產物葡萄糖和果糖進行自身代謝[36]，同時變異鏈球菌的GTFB酶可與白色念珠菌表面的甘露聚糖受體結合增加其黏附力，表現為雙物種生物膜中變異鏈球菌數量的增加，增加了生物膜的致齲潛力[37]。并且在變異鏈球菌和白色念珠菌的雙物種生物膜中變異鏈球菌的蔗糖代謝和白色念珠菌的葡萄糖代謝都會導致菌斑內pH值降低，因此這種雙物種生物膜比單一的變異鏈球菌短時間內產酸更多，同時白色念珠菌產生的蛋白酶可以破壞牙本質的膠原，加速齲損的進展[36]。干酪乳桿菌和放線菌在晚期齲齒中和根面齲中常被發現，在體外研究中發現它們都不能單獨定植于牙齒表面，而變異鏈球菌可以大大增加它們對牙面的定值和聚集[38]，從而增加牙菌斑生物膜中的產酸量，增加致齲潛力。生物膜中的細菌不但有很高的產酸的能力，同時還具有很好的耐酸能力。在低pH的條件下，游離狀態下的變異鏈球菌已經喪失了分解代謝糖的能力，然而生物膜中變異鏈球菌的gtfbc基因表達仍明顯增加，可產生更多的水不溶性多糖，維持其代謝活性[5]。

3.2 細菌毒力因子的表達與進化

細菌毒力是高度動態變化且依賴環境。對細菌的致病性的研究一般從兩個方面進行，病原-宿主之間的權衡互動或是微生物群體之間的相互作用從而影響其毒性。大部分細菌中都含有毒力因子，但是毒力因子并不等于毒力。Kuboniwa等[39]發現體外的可溶性介質4-氨基苯甲酸/對氨基苯甲酸（pABA）可以促進牙齦卟啉單胞菌產生葉酸和纖維黏附蛋白高表達，并且在小鼠口腔中pABA可促進牙齦卟啉單胞菌的定植和存活，同時也可抑制細菌細胞外多糖的產生，降低其致病性。說明毒力大小和細菌數量并不是一定相關。毒力因子需要基因表達并且避開宿主的一系列防御機制才能形成一定的毒力并且損傷宿主。所以除毒力因子外，宿主的易感性是另一個重要因素。細菌的毒力因子的進化主要來源于2個方面：其一是通過改變細菌的基因型增強毒力；其二是不改變基因型而是通過改變表現型從而改變毒力[40]。有研究表明細菌毒力依賴于遺傳變異。通過細菌與細菌之間的基因的轉移，無論是導致基因片段的增加或是喪失都會引起細菌基因的進化。質粒和噬菌體等移動遺傳元件在基因水平轉移中發揮著重要的作用，它們可以清除對宿主有害的基因，增強宿主的適應性，其中包括宿主的毒力性狀的增強[41-42]。Hao等[43]發現，在變異鏈球菌基因水平轉移的過程中可獲得106個基因，包括編碼與運輸蛋白相關的基因、果聚糖水解酶和蘋果酸乳酸酶基因、編碼絲狀蛋白的基因等，來提高對糖的攝取，分解代謝能力，黏附能力和在低pH條件下的生存能力。

在不改變細菌的基因型只改變表現型也可以增強細菌毒力，這種現象稱之為細菌的“可塑性”[40]。當細菌處于感染細胞或組織部位時可能會遇到不同的微環境，各個細菌之間的基因表達和表現特性就會存在差異[44]。為了更好適應環境，增加其生長速率和毒性，變異鏈球菌可以通過mRNA和sRNA控制基因的轉錄和翻譯，實現毒力因子基因表達的微調[45]。

作為宿主防御反應之一，宿主也會通過一些細菌的定植來拮抗致病菌從而保證宿主的健康。例如血鏈球菌作為早期定值于牙面的細菌之一，會通過產生過氧化氫來抑制變異鏈球菌的生長繁殖，從而降低牙菌斑生物膜的致齲性[46]。當一種細菌或宿主產生有毒化合物影響了其他的細菌時，其他細菌就會選擇性和可以分解此毒性化合物的細菌產生共聚，這些敏感菌株會受到抗性菌株的保護。當有毒化合物存在時，細菌的物種豐富度會朝著可以分解這些毒化物的細菌轉變。從而減少生態群落中的有毒物質，減輕細菌致病性。同時也從另一個角度說明了生物膜中的細菌組成是具有選擇性和動態性的[12,47]。

4 細菌間的信號傳導

在牙菌斑生物膜中生活著大約700種細菌[48]，這些細菌不是隨機的堆積而是通過相互的交流和協調形成的選擇性群落。為了生存細菌會通過群體感應系統（quorum sensing，QS）感知口腔系統環境變化，細菌可以分泌、釋放、響應小的化學信號分子Als，當其密度達到一定的閾值時就會被環境中其他細菌感知，以此來調節基因表達、生物膜的形成及毒力的表達[49-50]。Autoinducer-2（AL-2）由LuxS合成存在于變形鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、戈登鏈球菌等細菌中[4,48]。目前已經證實AL-2和細菌的毒力產生、細胞運動和生物膜的形成有關[51]。Hu等[52]發現LuxS基因的缺乏會導致的變異鏈球菌的乳酸脫氫酶產量下降，形成的生物膜中存在較大的間隙并且表面更加粗糙[53]。在金黃色葡萄球菌的例子中，AL-2在受到正反饋信號時可以促進AgrA的磷酸化從而增加外毒素分泌[54]，而外源性AL-2可以增加銅綠假單胞菌生物膜基因和毒力基因的表達，但是過度增加AL-2的濃度也會抑制生物膜的形成[4,54-55]。因此可以認為AL-2對于細菌生物膜的形成和毒力的表達有重要意義。

變異鏈球菌中存在失活感受態刺激肽（Csp）和sigX誘導肽（XIP）兩種群體感應信號，這些信號分別通過comDE和comRS雙組份調節系統進行調節[56]。Wenderska等[30,57-59]發現通過comRS和comDE雙組份調節系統分泌寡肽，通過正反饋回路到達細胞外環境中，直到積累至克服閾值濃度時激活各個系統，調節變異鏈球菌的遺傳能力和毒力，并參與合成基因轉錄的啟動子、抑制非致齲菌生長的變鏈素和調控多個細菌素基因，并且表現出高度的特異性。Csp最初被描述為群體感應信號，使個體細胞具有能夠調節相應密度的能力，但在最近的研究表明Csp除了感受密度外還可感受環境中的PH值、抗生素、細胞的歷史信息等，同時參與細胞的重組和“自相殘殺”，獲取可以抵抗不利環境的優勢基因。

環二磷酸腺苷單磷酸（c-di-AMP）和環狀二鳥苷酸GMP（c-di-GMP）作為細菌的第二信使，控制著細菌的信號傳導。它們在變異鏈球菌中的功能尚不明確，但是Cheng等[60]發現，當變異鏈球菌中cdaA基因的缺失會導致c-di-AMP水平降低，同時有200多個基因上調或者下調，對過氧化氫敏感性增加，細胞外多糖產量上升，影響生物膜形成。Yan等[61]發現，細胞外c-di-GMP不會進入細胞，通過c-di-GMP受體或者攝取影響信號傳導系統，在不影響細菌的生長速率的前提下可以抑制變異鏈球菌在非生物表面上生物膜的形成。所以研究c-di-AMP和c-di-GMP信號傳導系統對預防治療齲病提供了新的思路。

5 小結

生物膜的性質主要取決于先鋒菌，它在共聚作用中決定了其他合作細菌的種類，共聚作用使細菌之間緊密接觸，促進不同種微生物之間的相互作用。在真正的合作伙伴關系中，所有物種都會從其他物種中受益。細菌的相互作用就是選擇共同利益的細菌一起抵抗外界不良環境，維持自身的存活和發展。由于牙菌斑中微生物具有復雜的多樣性，存在著復雜的相互作用，但最終會形成穩定的生物群落，這是在微生態系統中所有微生物長期持續“戰爭與和平”的結果。研究明確菌斑內微生物間的相互作用有利于更好的理解牙菌斑致病的過程和機制，對于治療齲病及牙周病具有重要意義。