CSE1L在人喉鱗癌頸淋巴結轉移中的作用研究

張繼華，李 浩，張媛媛，蘇 靜，薛海濤

(河北醫科大學第一醫院耳鼻咽喉科，河北 石家莊 050031)

喉鱗癌是耳鼻咽喉-頭頸外科的常見惡性腫瘤，國際流行病學調查顯示，喉癌占頭頸腫瘤的30%～40%，占全身腫瘤的1%～2.5%，T3、T4期喉癌淋巴結轉移發生率為40%～65%，同無淋巴結轉移患者相比，有淋巴結轉移喉癌患者5年生存率降低約50%[1]，頸部淋巴結轉移是導致患癌患者生存率降低的主要因素。目前臨床醫師主要根據術前影像學檢查資料來間接判斷患者是否存在頸部淋巴結轉移，進而決定是否行頸部淋巴結清掃術。但腫瘤早期轉移并不能導致相應淋巴結增大等異常表現，因此術前影像學檢查并不能為醫生提供確切的結果。臨床急需找到一種能準確而有效判斷患者是否存在淋巴結轉移的生物標志物，為臨床頸部淋巴結清掃術的實施提供客觀依據。最近研究證實，染色體分離樣蛋白1(chromosome segregation like 1 protein，CSE1L)在婦科腫瘤、淋巴瘤、結直腸腫瘤、乳腺腫瘤及肺腫瘤中均呈現高表達。CSE1L被認為與癌癥的進展和轉移有關。但其在喉癌中的表達情況尚少見報道。本研究對76例人喉鱗癌患者腫瘤組織及32例腫瘤周圍正常喉黏膜組織中CSE1L蛋白的表達進行了檢測，旨在探討CSE1L同人喉鱗癌頸部淋巴結轉移的關系，以為臨床頸部淋巴結轉移的判斷及頸部淋巴結清掃手術的實施提供更可靠的理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集并整理2016年1月—2018年12月河北醫科大學第一醫院收治的76例住院喉鱗狀細胞癌患者標本及病歷資料(患者術前均未經放化療)，其中診斷聲門上型患者48例，聲門型患者28例；32例癌旁正常喉黏膜組織取自距離腫瘤切緣不小于0.5 cm(病理檢查確認無腫瘤細胞存在)。76例喉鱗癌組織樣本具體情況如下，男性62例，女性14例；年齡32～76歲，平均58歲；淋巴結轉移39例(其中6例T1N1M0，5例T1N2M0，8例T2N1M0，9例T2N2M0，7例T3N1M0，2例T3N2M0，2例T4N1M0，0例T4N2M0)，無淋巴結轉移37例(其中12例T1N0M0，12例T2N0M0，7例T3N0M0，6例T4N0M0)。臨床分期：17例Ⅰ期,23例Ⅱ期,30例Ⅲ期，6例Ⅳ期。腫瘤分化程度：38例高分化，13例中分化，25例低分化。所有研究樣本均經病理科兩位副高以上職稱醫生確認。

1.2主要試劑及儀器設備 CSE1L免疫組織化學用多克隆抗體，武漢博士德公司，工作濃度為1∶85。免疫組織化學用SP染色試劑盒、DAB顯色用試劑，北京中杉金橋生物公司。倒置顯微鏡X-PC-2型倒置相差顯微鏡，日本OLYMPUS。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學切片 修剪留取組織標本，常規脫水、固定、石蠟包埋，蠟塊進行連續切片，厚度5 μm，切片稍干后4 ℃冰箱低溫保存備用。

1.3.2免疫組織化學指標檢測及方法 ①復溫：于冰箱內取出切片，使其溫度上升至室溫。②抗原修復：將切片置于0.01 mol/L、pH 6.0的檸檬酸緩沖液中，以高溫高壓熱修復抗原2 min。待其溫度恢復至室溫后，蒸餾水沖洗兩次，PBS液浸洗5 min。③滅活內源性過氧化物酶：3%的雙氧水孵育10 min，蒸餾水沖洗兩次，PBS液浸洗5 min。④加一抗：滴加兔抗人CSE1L多克隆抗體一抗工作液(10 μL/份)，稀釋度分別為1：85，37 ℃孵育1 h，用已知表達陽性切片做陽性對照，用0.1 mol/L PBS代替一抗作陰性對照。PBS沖洗5 min,共3次。⑤加二抗：滴加PV6001二抗，37 ℃孵育30 min，0.1 mol/L PBS沖洗5 min,共3次。⑥DAB顯色液顯色，顯微鏡下控制顯色時間，自來水終止顯色5 min。⑦蘇木素復染細胞核(5 min)，再依次經過1%酸性酒精分化(30 s)、1%氨水返藍(1 min)、70%酒精(10 min)、80%酒精(10 min)、90%酒精(10 min)、100%酒精Ⅰ(20 min)、100%酒精Ⅱ(20 min)、二甲苯Ⅰ(20 min)、二甲苯漂洗Ⅱ(20 min)、中性樹脂封片。

1.3.3結果判斷 采用半定量雙評分法，顯微鏡高倍鏡視野下根據陽性細胞所占比例以及細胞染色強度做綜合判定。表達強度評分標準：不著色，記0分，黃色，記1分，棕黃色，記2分，棕褐色，記3分。陽性細胞所占視野細胞比例評分標準：陽性細胞百分率<25%，記0分；陽性細胞百分率25%～50%，記1分；陽性細胞百分率51%～75%，記2分；陽性細胞百分率>75%，記3分。兩種方法所得評分和，得分0～1為目的蛋白陰性(-)；得分2為目的蛋白弱陽性(+)；得分3～4為目的蛋白陽性(++)，得分5～6為目的蛋白強陽性(+++)。

1.3.4Western法測腫瘤細胞內CSE1L蛋白表達 參照試劑說明書，提取樣本蛋白，制備Western blot檢測樣品，檢測各組樣品蛋白濃度，常規上樣，配制選用12%分離膠以及4%濃縮膠，每組樣品上樣量65 μg，同時設置Marker預染蛋白，100 V電泳約1 h 25 min，轉膜30 V，0.9 mA過夜。洗膜，定影后進行圖象分析。

1.4統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件分析數據。計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1免疫組織化學檢測CSE1L蛋白在人喉鱗狀細胞癌及喉正常黏膜組織中的表達 39例有淋巴結轉移患者中CSE1L蛋白陽性表達率為97%(38/39)；強陽性表達31例，中等強度表達6例，弱陽性表達1例，陰性1例。37例無淋巴結轉移患者中CSE1L蛋白陽性表達率為38%(14/37)；強陽性表達2例，中等強度表達11例，弱陽性表達1例，陰性23例。32例瘤體周圍正常喉黏膜組織標本中CSE1L蛋白均為陰性表達。見圖1。

圖1 CSE1在喉鱗癌組織及癌旁正常黏膜組織中的表達情況(SP ×200)

2.2Western Blot檢測CSE1L蛋白在人喉鱗狀細胞癌組織及癌旁正常黏膜組織中的表達 喉鱗癌伴淋巴結轉移組CSE1L蛋白表達明顯高于喉鱗癌無淋巴結轉移組，差異有統計學意義(P=0.041)；喉鱗癌無淋巴結轉移組CSE1L蛋白表達明顯高于癌旁正常黏膜組，差異有統計學意義(P=0.022)。見表1。

表1 CSE1L在喉鱗癌及癌旁正常喉黏膜中的表達情況

2.3CSE1L蛋白表達與喉鱗癌患者臨床病理特征的關系 不同性別、年齡、原發部位、臨床分期、病理類型及T分級喉癌組織中CSE1L的陽性表達率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 CSE1L的表達與喉鱗癌患者臨床病理學特征的關系

3 討 論

喉鱗癌是耳鼻咽喉-頭頸外科的常見惡性腫瘤，但由于喉癌的高淋巴結轉移率，尤其是T3，T4期喉癌淋巴結轉移發生率為40%～65%，使的這一部分患者5年生存率明顯降低，同無淋巴結轉移患者相比，有淋巴結轉移喉癌患者5年生存率降低約50%[1]，復發和轉移是導致喉癌病死率居高不下的主要原因，其中尤以聲門上型及聲門下型患者居多[2]。由于其發病部位隱匿，多數患者就診于腫瘤晚期。

目前喉癌臨床治療仍以手術為主，單側或雙側頸淋巴結清掃術是T3和T4期腫瘤標準治療方案的一部分。但由于頸部是人體重要神經、血管的集中部位，相鄰組織之間的關系密切，手術在徹底切除腫瘤的同時，也給患者帶來諸如失聲、吞咽困難、鄰近重要神經、血管損傷等嚴重并發癥，而同時行頸部淋巴結清掃術，無疑進一步加重了對患者的損傷，增加手術時間及住院時間，進一步降低了患者的生活質量。目前臨床醫師主要根據術前影像學評估頸部淋巴結轉移情況及選擇術式，但有一定局限性。使得目前頸淋巴結清掃術存在一定的盲目性，部分早期轉移癌患者未行頸淋巴結清掃術，手術未能徹底切除腫瘤；部分未發生轉移的患者卻進行了頸淋巴結清掃術，加重了不必要的損傷。因而臨床急需找到一種能準確而有效判斷患者是否存在淋巴結轉移的生物標志物，為臨床頸部淋巴結清掃術的實施提供客觀依據。

CSE1L負責調解importin-α從細胞核中的運輸，在細胞質和細胞核中均有表達[3-4]。CSE1L可以與細胞微管和紡錘體相聯系，通過刺激腫瘤細胞增殖來促進癌癥進展。還通過增強腫瘤組織中的基質金屬蛋白酶2(matrix metallo proteinase-2,MMP-2)分泌，通過調節P53基因的表達，增加腫瘤侵襲性[5-7]。 因此，在某些癌癥類型中，CSE1L被認為與癌癥的進展和轉移有關[8-9]。最近研究證實，CSE1L在婦科腫瘤、淋巴瘤、結直腸腫瘤、乳腺腫瘤及肺腫瘤中均呈現高表達[10-14]。

在頭頸腫瘤方面，有關CSE1L的研究較少，Wang等[15]研究表明，CSE1L同鼻咽癌患者預后無關。然而，Li等[16]報道，CSE1L在鼻咽癌細胞凋亡、侵襲及轉移方面發揮作用。Wang等[13]報道，CSE1L在區分伯基特淋巴瘤和彌漫性大B細胞淋巴瘤中起著重要的作用。因此，有必要對喉鱗癌患者臨床特征同其淋巴結轉移之間的關系進行研究。

本研究通過免疫組織化學和蛋白印記Western Blot法對人喉鱗狀細胞癌組織及癌旁正常黏膜組織中CSE1L蛋白的表達進行了檢測，探討了CSE1L同人喉鱗癌頸部淋巴結轉移的關系。結果顯示39例有淋巴結轉移患者中CSE1L蛋白陽性表達率分別為97%(38/39)；強陽性表達31例，中等強度表達6例，弱陽性表達1例，陰性1例。37例無淋巴結轉移患者中CSE1L蛋白陽性表達率分別為38%(14/37)；強陽性表達2例，中等強度表達11例，弱陽性表達1例，陰性23例。32例瘤體周圍正常喉黏膜組織標本中CSE1L蛋白均為陰性表達。有淋巴結轉移的患者中，喉鱗癌組織中CSE1L的陽性表達率高于無淋巴結轉移的患者喉鱗癌組織，差異有統計學意義。不同性別、年齡、原發部位、臨床分期、病理類型及T分級喉癌組織中CSE1L的陽性表達率比較差異均無統計學意義。

綜上所述，CSE1L有可能成為判斷人喉鱗癌頸部淋巴結轉移生物學標志物。為臨床頸部淋巴結轉移的判斷及頸部淋巴結清掃手術的實施提供更可靠的理論依據。