FAM167A-BLK基因多態性與類風濕關節炎病情活動的相關性研究

操雪 楚天舒

河南省人民醫院 鄭州大學人民醫院河南大學人民醫院風濕免疫科，鄭州 450003

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性疾病，在全球范圍內發病率約為0.5%～1.0%，它以反復發作的滑膜炎及血管翳的形成為病理基礎，臨床主要表現為對稱性多關節滑膜炎，從而造成關節軟骨及骨的破壞，可引起明顯的關節疼痛、僵硬、活動受限，最終導致關節畸形，此外，還多伴有關節外系統性損害，嚴重危害患者的健康和生活質量［1-3］。但現如今，由于RA 發病的復雜性，病因及機制仍未完全闡明，臨床上缺乏根治本病的有效措施，一般資料相似的RA患者，療效異質性仍較明顯。因此深入研究RA 發病機制，對改進治療策略提供參考意義重大［4］。近年來，遺傳因素在RA易感性、病情活動度方面受到重視，如針對高表達的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α）的靶向治療已比較成熟，但部分患者療效欠佳，因此推測個體基因可能參與了RA 的發病［5］。許多全基因組關聯研究（genome-wide association studies，GWAS）已經證實單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）與自身免疫性疾病相關，其中，非人類白細胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）的序列相似性家族167A-B 淋巴酪氨酸激酶（family with sequence similarity 167A-B lymphoid tyrosine kinase，FAM167A-BLK）基因多態性已證實與系統性紅斑狼瘡、干燥綜合征等自身免疫性疾病的發生密切相關，但是否與RA 有關尚未得到廣泛研究［6］。因此，本研究旨在探索FAM167A-BLK基因多態性與RA病情活動的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究為單中心前瞻性隊列研究。選取2019年9月至2020年9月河南省人民醫院住院部收治的 309 例 RA 患者。（1）入院標準：均符合 1987 年或 2010 年美國風濕病學會（ACR）的 RA 分類標準［7］。（2）排除標準：①肝、腎功能嚴重受損患者；②直系親屬或本人合并有其它自身免疫性疾病病史；③近1 月內有感染者；④配合度較差者。根據疾病活動度分為低活動組162 例，男87 例，女75 例，年齡范圍為28～65 歲，年齡（45.24±8.33）歲；高活動組 147 例，男 70 例，女 77 例，年齡范圍為 30～68 歲，年齡（44.96±7.01）歲。所有參與者均對本研究知情，自愿簽署知情同意書。

本研究經河南省人民醫院倫理委員會審批通過（2019-41）。

1.2 方法

1.2.1 RA 活動度評估 根據類風濕關節炎疾病活動評分（disease activity score 28，DAS28）［8］，以28 個關節記分：包括雙手掌指關節、雙手近端指間關節、雙肩關節、雙肘關節、雙腕關節和雙膝關節，并根據以下公式計算：DAS28（CRP）=0.56 ×sqrt（TJC28）+0.28 ×sqrt（SJC28）+0.36×Ln（CRP +1）+0.014 ×GH +0.96。低活動組：DAS28 評分＜3.2分，高活動度組：DAS28評分≥3.2分。

1.2.2 標本采集與檢測 EDTA 抗凝管采集患者外周血4 ml，根據DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）說明書提取 DNA。 在Hapmap 數據庫查詢FAMl67A-BLK 的各SNP 位點位置，選取最小等位基因頻率≥5%SNP位點進行研究。通過MALDI-TOF MS 系統對所選 FAMl67A-BLK 的 4 個 SNP 位點（rs13277113、rs7812879、rs2736340、rs2254546）進行基因分型。先通過PCR 擴增出目標序列，特異性引物序列及PCR 反應體系如表1～2 所示。隨后加入SNP序列特異性延伸引物（表3），制備的樣本分析物與芯片基質共結晶后將結晶體放入質譜儀真空管中，瞬時強激光激發，根據到達檢測器的飛行時間不同而被分離檢測。 最后，應用軟件MassARRAY RT 及MassARRAY Typer完成基因分析。

表1 引物序列

表3 單堿基延伸反應體系

1.3 觀察指標 （1）比較兩組患者的年齡、性別、體質量指數（BMI）、民族、戶口所在地、合并疾病。（2）分析基因分型質量與Hard-Wemberg 平衡檢驗結果。（3）比較兩組各SNP位點基因型。（4）比較兩組等位基因分布情況。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計學軟件處理數據，計量資料進行正態分布，行Kolmogorov-Smirnov 檢驗，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，行t檢驗，不符合正態分布的計量資料以中位數表示，行Mann-WhitneyU檢驗。計數資料用例（%）表示，行χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般資料 兩組患者的年齡、性別、BMI、民族、戶口所在地、合并疾病比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），均衡可比，具體見表4。

表4 兩組類風濕關節炎患者一般資料比較[例（%）]

2.2 基因分型質量與Hard-Wemberg 平衡檢驗FAMl67A-BLK 的 SNP 位 點 rs13277113、rs7812879、rs2736340、rs2254546 分型成功率＞90%，實驗中為檢測基因分型質量的可重復性，設置的30 份重復樣本分型結果吻合率為100%，提示基因分型結果可靠。rs13277113、rs7812879、rs2736340、rs2254546 均符合 Hard-Wemberg 平衡檢驗定律（P=0.512、0.334、0.718、1.000），表明入組者代表性良好。

表2 PCR反應體系液

2.3 兩組各SNP 位點基因型 兩組FAMl67A-BLK 的SNP 位點 rs13277113、rs7812879、rs2736340、rs2254546 基因型比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），具體見表5。

表5 兩組類風濕關節炎患者各SNP位點基因型比較[例（%）]

2.4 兩組等位基因攜帶者與頻率分布 高活動組FAMl67A-BLK rs13277113位點G等位基因、rs7812879位點T等位基因、rs2736340位點C等位基因、rs2254546位點A等位基因攜帶者均低于低活動組（均P＜0.05），具體見表6。FAMl67A-BLK 各SNP 位點等位基因頻率分布呈現出相似規律（均P＜0.05），具體見表7。

表6 兩組類風濕關節炎患者等位基因攜帶者分布比較[例（%）]

表7 兩組類風濕關節炎患者等位基因頻率比較（%）]

3 討 論

RA 是一種慢性殘毀性關節炎，具有致畸性、致殘性，而控制疾病活動度，促進病情緩解是改善患者預后的重要策略，因此從基因角度闡明影響RA 活動度的因素，有助于發現影響RA病情活動的原因，對病情轉歸具有積極意義［9-10］。

FAMl67A-BLK 基因 區域位于染 色體 8p23.22 上［11］。Song 等［12］報 道 顯 示 ，FAMl67A-BLK 的 SNP 位 點rs13277113、rs2736340 與橋本氏甲狀腺炎有關。Chen 等［13］研究發現，FAM167A-BLK基因中多態性與漢族人群的多肌炎/皮肌炎有關。均提示FAMl67A-BLK 基因多態性與自身免疫疾病有關，但在RA 中的報道較少。本研究顯示，不同病情活動度患者FAMl67A-BLK 的SNP 位點rs13277113、rs7812879、rs2736340、rs2254546 基因型比較差異顯著，表明FAMl67A-BLK基因多態性與RA病情活動有關。同時本研究還發現，RA 高活動患者FAMl67A-BLK rs13277113 位點G等位基因、rs7812879位點T等位基因、rs2736340位點C等位基因、rs2254546 位點A 等位基因攜帶者均低于低活動患者，對應的等位基因頻率亦低于低活動患者，提示rs13277113 位點 G 等位基因、rs7812879 位點 T 等位基因、rs2736340 位點 C 等位基因、rs2254546 位點 A 等位基因與RA病情活動相關。

BLK 基因編碼產物主要表達于B 細胞，是src 酪氨酸激酶家族成員之一，能通過B 細胞信號通路被激活，并在信號級聯放大作用下，激活下游核轉錄因子，從而調控B 細胞生長、發育［14-15］。研究發現，當 B 淋巴細胞表達的 BLK 突變活躍時，可促進前B 淋巴細胞的增生，增強其對白介素的反應性［16］。而白介素-6、白介素-4 等已被證實在 RA 中異常表達，可引導已經激活的B 細胞分化成熟，轉化為免疫球蛋白分泌活性的漿細胞，并能調控T 調節細胞的分化，構成促炎性環境，從而增加RA 活動度，加重RA 病情。且當BLK 基因調控BLK 蛋白表達時，會影響B 細胞的耐受機制，打破Th17/Treg 間的平衡，介導過度免疫，使機體易產生自體免疫，從而影響 RA 病情活動情況［17］。FAMl67A 基因的功能現階段尚不清晰，根據 Mentlein 等［18］研究，FAMl67A 可通過編碼無序自身免疫蛋白，介導自身過度免疫，從而導致RA。本研究不足支持在于，納入病例數較少，且FAMl67A-BLK的SNP位點在分子水平如何影響RA活動度仍未明確，有待進一步基因功能的研究去探索。

綜 上 所 述 ，FAMl67A-BLK 的 SNP 位 點 rs13277113、rs7812879、rs2736340、rs2254546 基因型在不同 RA 病情活動患者中存在顯著差異，FAMl67A-BLK rs13277113 位點G等位基因、rs7812879位點T等位基因、rs2736340位點C等位基因、rs2254546位點A等位基因與RA病情活動密切相關。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。