維生素D 受體基因多態性與妊娠期糖尿病的關系

陳慧敏 蕭敏華 孫靜 吳錦暉 羅紅鳳 劉喜紅

廣州醫科大學廣州市婦女兒童醫療中心（廣州 510623）

妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）是指孕期首次發現的任何程度的糖耐量異常［1-2］。GDM 已成為全球主要的公共衛生問題，我國GDM 的發病率高達11.9%～18.9%［3-4］，并逐年上升。GDM嚴重危害母嬰健康，增加了母嬰圍產期并發癥的發生風險［5］，也與母親及后代的2 型糖尿病等代謝性疾病密切相關［6］。

VDR 基因多態性的國內外研究在2 型糖尿病患者的人群研究較多，結果尚不一致［7-9］，而關于GDM 人群的文獻報道較少，結論存在爭議，且存在樣本量偏少，忽視控制混雜因素等問題［10-11］。基因多態性還存在國家、地域的差異性［12］，因此更有必要在中國GDM 人群中進一步開展研究。為深入探索GDM 是否與VDR 基因多態性有關系，本研究分析了中國人群VDR 基因（rs2228570 G ＞A，rs739837 G＞T）的多態性與GDM 的關系，探討GDM的遺傳易感因素及可能的發病機制，對妊娠糖尿病的預測、從醫學營養的角度預防和治療都具有重要的意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象本研究是一項基于中國人群的病例-對照研究。2019 年6-11 月，在廣州市婦女兒童醫療中心產科門診建檔的孕婦中，招募符合標準的研究對象。納入標準：年齡22～40 歲，單胎，孕齡24～28 周，彼此為無血緣關系的個體，自愿參與本研究。排除標準：孕前原有的糖尿病、多囊卵巢綜合征、高血壓等基礎疾病及其他影響血糖調節的疾病，多胎妊娠，不能配合研究實施者。按我國的GDM 診斷標準［1］及2019 年美國ADA 糖尿病診斷標準，孕24～28 周時口服75 g 葡萄糖耐量試驗（OGTT）結果任何一點達到或超過臨界值（空腹5.1 mmol/L，1 h 10.0 mmol/L，2 h 8.5 mmol/L）即診斷為GDM。由Quanto1.2.4 軟件根據等位基因頻率及患病率等估算樣本量，并保證對照組樣本量大于病例組。篩選符合診斷標準及納入標準的GDM孕婦555 例為病例組，在同一門診選擇與檢測日期、孕周和孕產次相匹配的646 例正常孕婦為對照組。本研究獲得廣州市婦女兒童醫療中心倫理委員會的批準（第114A01 號），并與孕婦簽署了科學研究知情同意書。通過問卷調查和半結構式訪談收集一般資料和病史。

1.2 病例資料（1）孕前BMI=孕前體質量（kg）/身高（m）2，孕前體質量由孕婦提供，身高為招募時體格測量值。（2）孕晚期糖化血紅蛋白（HbA1c）是指孕28～32 周的血液檢驗數據。（3）糖尿病或高血壓家族史定義為一級親屬（父，母，兄弟姐妹）或二級親屬（祖父母，外祖父母，父母的同胞）至少1 人患糖尿病或高血壓。（4）不良孕產史包括不孕不育、自然流產、死胎、死產、生育畸形或智力低下兒等。

1.3 研究方法

1.3.1 候選基因位點的選擇結合常用的NCBIdbSNP（single nucleotide polymorphism，SNP）數據庫，選擇的SNP 位點主要位于5′UTR 非編碼區（5′-untranslatedregion）、3′UTR 和外顯子等基因功能區域，可以導致與轉錄起始因子結合能力改變、microRNA 結合能力改變或引起氨基酸改變等，從而導致不同的生理功能。根據千人基因組數據庫選擇位點在中國正常人群中最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.05 及低連鎖不平衡（R2＜0.8）。綜合考慮以上因素最終選擇了維生素D 受體基因的2 個SNP 位點：位于基因5′端第2 外顯子起始密碼子的突變rs2228570 和3′UTR 的rs739837。

1.3.2 基因多態性分析所有研究對象留取EDTA抗凝全血2 mL，用于提取DNA。利用DNA 抽提試劑盒（MaGen 美基生物公司）按標準操作流程提取基因組DNA。將合格DNA 樣品稀釋至10 ng/μL，裝入96 孔板中。引物和探針由美國應用生物系統（ABI）公司合成，采用Taqman SNP 基因分型試劑盒，應用ABI Quant StudioTM實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）系統對這兩個VDR 的SNP 位點進行基因分型。PCR 的反應條件設置為：95 ℃活化10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，共45 個循環。

1.4 統計學方法采用SPSS 19.0 進行統計分析，正態分布的計量資料用均數±標準差表示，比較分析采用t檢驗。計數資料用例數和百分數描述，兩組間比較采用χ2檢驗。對基因多態性數據進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗（HWE），其中顯性遺傳模型（aa+Aa/AA）、隱性遺傳模型（aa/Aa+AA），a為突變等位基因，A 為野生等位基因。多因素分析采用非條件logistic 回歸。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料病例組和對照組孕婦的年齡、孕次和產次的比較差異無統計學意義（P＞0.05）。GDM 患者的孕前BMI、OGTT 血糖值、孕晚期糖化血紅蛋白（HbA1c）、糖尿病家族史、高血壓病家族史和不良孕產史發生率顯著高于正常孕婦對照組（P＜0.05），見表1。

表1 病例和對照組一般資料的比較Tab.1 Comparison of general data between the case and control group

表1 病例和對照組一般資料的比較Tab.1 Comparison of general data between the case and control group

2.2 維生素D受體基因多態性與GDM的遺傳易感性關系對照組符合HWE 平衡（rs2228570 G ＞A，P=0.692；rs739837，G ＞TP=0.236），證實本研究的資料具有群體代表性。選擇的兩個SNPs 位點的基因型分布、等位基因頻率和不同遺傳模型分析見表2，rs2228570 位點的基因型和等位基因頻率在病例和對照組間差異有統計學意義（P＜0.05），在顯性模型下表現出與GDM關聯（P＜0.05）；rs739837 位點的多態性分析在兩組間的差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 VDR 基因的SNPs 位點多態性和GDM 遺傳易感性的關系Tab.2 Association between VDR gene SNPs and genetic susceptibility of GDM 例（%）

2.3 VDR 基因多態性與GDM 發生的多因素分析以是否GDM 為因變量，年齡、孕前BMI、糖尿病家族史、不良孕產史、高血壓家族史、rs2228570位點多態性為自變量進行logistic 回歸分析，自變量賦值見表3。結果顯示：年齡、孕前BMI、不良孕產史、高血壓家族史和rs739837 位點多態性與GDM 無關（均P＞0.05），rs2228570 位點多態性和糖尿病家族史是GDM 的獨立危險因素（P＜0.05），見表4。

表3 自變量賦值表Tab.3 Independent variable assignment table

表4 GDM 影響因素的logistic 回歸分析Tab.4 Logistic regression analysis of influencing factors for GDM

3 討論

維生素D 受體為親核蛋白，作為配體依賴性轉錄因子，是核激素受體家族的一員。人類VDR基因位于第12 染色體長臂q13～14 區，整個基因組由9 個外顯子和8 個內含子組成。rs2228570 位點，也稱為FokI 限制性內切酶的酶切位點，位于VDR 蛋白翻譯的起始位點，是目前唯一已知的可以改變蛋白結構的VDR 的單核苷酸多態性［13］，產生424 或427 個氨基酸兩種不同的蛋白質，在胰島素的代謝途徑中發揮作用［14］。rs739837 位于3′UTR 非編碼區，其變異不影響氨基酸序列，不太可能影響VDR 本身的功能，但它可能位于能夠調節VDR 表達的microRNA 的結合位點，可調節基因的表達，尤其對mRNA 的穩定性有調控作用。

目前在GDM 人群中關于rs2228570（FokⅠ）位點的研究結果存在矛盾。SIQUEIRA 等［10］報道了巴西人群GDM 與VDR 受體基因FokⅠ多態性沒有關系。ASLANI 等［15］在伊朗人群中的研究發現rs2228570 多態性與GDM 的風險增加有關聯。APAYDIN 等［11］在土耳其人群發現FokⅠ多態性與GDM 的發生有關系，其變異可能導致GDM 患者胰島素抵抗受損和代謝紊亂。本研究樣本量更充足，結果支持rs2228570 位點多態性與GDM 的發病有關系，可能在GDM 的發病機制中起潛在作用這一論點。與對照組比較，GDM 組等位基因A 的頻率更高。從GDM 發病風險來看，A 等位基因攜帶者是G 等位基因攜帶者的1.72 倍，GA 基因型攜帶者是GG 基因型的2.80 倍，AA 基因型攜帶者是GG基因型的3.98 倍。在顯性模型下表現出與GDM 有關聯，至少攜帶1 個等位基因A 的個體是非攜帶者患病風險的3.07 倍。結果提示AA 基因型為易感基因型，而A 等位基因為易感基因?；钚跃S生素D需通過與VDR 結合而顯示其細胞活性，調節胰腺β 細胞的胰島素分泌［16］。A 等位基因編碼較長的VDR 蛋白質［17］，轉錄的活性較弱，從而造成生理功能的下降，可能導致胰島素合成和分泌缺陷，在GDM 發病機制中起一定作用。總之，本研究表明rs2228570 位點多態性是GDM 的獨立危險因素，今后通過VDR 的基因分型可以發現GDM 易感人群，從而提供有針對性的維生素D 補充建議。

研究表明rs739837 與中國人群2 型糖尿病及其脂質代謝有關系［18-19］，該位點變異增加了2 型糖尿病的患病風險。但在妊娠期人群中沒有觀察到病例和對照之間rs739837基因型頻率的顯著差異。雖然GDM 和2 型糖尿病可能具有相似的風險因素和遺傳易感性［20］，但本研究的結果提示rs739837 與GDM 沒有顯著關聯，與既往在2 型糖尿病人群的結果不一致，可能的原因包括：（1）rs739837 的變異并不影響VDR 基因的功能，在GDM 發病機制中所起的作用較弱。（2）GDM 發生在育齡婦女，妊娠后受胎盤分泌的激素影響加重了胰島素抵抗［21］，在發病年齡、性別和妊娠生理特點等方面與2 型糖尿病有明顯的區別。（3）不同研究群體的結果差異可能與地域、環境、樣本量和實驗方法等因素有關。

本研究的創新點在于：在中國人群中發現了rs2228570 位點與GDM 的關聯，為尋找中國GDM孕婦的易感基因提供了新的理論依據，并探討了VDR 基因多態性在GDM 發病機制中可能的作用。雖然研究設計合理，但也存在一些局限性：首先，沒有檢測血清維生素D 水平，缺乏相關的分析。其次，選取了2 個位于功能區的SNPs，數目較少，今后可增加位點數目以獲得更為全面的結果。最后，研究對象來自同一家醫療機構，缺乏對地域、環境及生活方式等因素的分析，今后可開展多中心、大樣本、不同地區人群的關聯研究以及功能學研究進一步證實本實驗結果。

綜上所述，中國人群中VDR 基因rs2228570 位點多態性與GDM 的發生有關系，可能是GDM 的易感基因之一。本研究結果可為鑒定GDM 早期風險預測的生物標志物以及發病機制的探索提供科學依據，為GDM 的預防和治療提供新的思路。