鹽酸納美芬聯合迷走神經電刺激對肺缺血-再灌注損傷大鼠肺組織強啡肽及IL-17 的影響

徐標 李文華 吳威

武漢市第四醫院（華中科技大學附屬武漢普愛醫院）（武漢 430035）

肺缺血-再灌注損傷病理變化表現為肺泡-毛細血管網狀結構通透性增高，進而引起間質水腫及炎性細胞浸潤、肺泡上皮細胞損傷及凋亡，最終導致肺水腫、通氣/換氣功能障礙，其發病機制可能與炎性介質釋放增加等因素有關［1-3］。目前對肺缺血-再灌注損傷的防治研究手段單一、效果不佳且藥物防治研究多集中于“預防作用”，即在缺血期前給藥，然而在面對休克、心肺復蘇等危重癥救治過程中已經發生肺缺血-再灌注損傷的病理生理狀態時如何治療，目前卻研究甚少，更缺乏多種治療方式聯合應用的研究。近期研究表明迷走神經電刺激可減輕急性肺損傷［4］，而納美芬可通過抑制TLR4 信號通路減輕肺缺血-再灌注損傷［5］。因此本研究將納美芬、迷走神經電刺激聯合應用于大鼠肺缺血-再灌注損傷模型，探討多種治療方式聯合應用能否更有效地防治肺缺血-再灌注損傷及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級雄性SD 大鼠75 只，動物許可證號：SCXK（鄂）2010-0009，體質量（200±50）g，購自同濟醫學院動物實驗中心，在潔凈動物飼養室內自由攝食、飲水。飼養室溫度保持在20～25 ℃，相對濕度保持在50%～70%。

1.2 主要藥物、試劑與儀器鹽酸納美芬注射液（商品名：樂萌，成都天臺山制藥有限公司產品），規格：1 mL：0.1 mg，批準文號：國藥準字H20080645，批號：11210502161。兔抗大鼠強啡肽、κ受體、IL-17單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）。髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。BCA 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。C9000光密度掃描儀（日本島津公司）。BL-420 型生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物模型建立、分組與給藥將75 只大鼠隨機均分為5 組，每組15 只。（1）模型組：參考何義等［6］方法開胸游離左肺門后，夾閉左肺門45 min（肺組織由淡紅色變成暗紫紅色，表明缺血阻斷成功）后解除阻斷，觀察5 min 后肺組織膨脹、顏色恢復（表明肺組織循環再灌注成功），繼續再灌注3 h。（2）迷走神經電刺激組：預先分離出左側頸迷走神經，參照模型組方法于再灌注成功時進行迷走神經電刺激，頻率30 Hz，脈寬0.5 ms，電流1.0 mA，刺激總時間為30 min（方法參考文獻［7］），同步繼續再灌注肺組織3 h。（3）納美芬組：參照模型組方法于再灌注成功時即刻尾靜脈注射納美芬（15 μg/kg），余處理同模型組。（4）納美芬+迷走神經電刺激組：預先分離出左側頸迷走神經，參照迷走神經電刺激組于再灌注成功時進行迷走神經電刺激，同時尾靜脈注射納美芬（15 μg/kg），余處理同模型組。（5）假手術組：只開胸游離左肺門，不行夾閉，在上述各組大鼠相同時間點尾靜脈注射等體積生理鹽水及處死大鼠。各組大鼠于再灌注3 h 后經右頸總動脈采血留取血標本后處死大鼠，留取左肺上葉組織待檢。

1.3.2 大鼠動脈血氣分析取大鼠動脈血標本經血氣分析儀檢測動脈血pO2值、pCO2值。

1.3.3 大鼠肺組織濕/干重（W/D）測定取左肺上葉組織，以0.9%氯化鈉溶液沖洗后用濾紙吸干多余水分后稱重，計量為濕重（W）；置80 ℃恒溫箱，烘烤72 h 至恒重后稱重，計量為干重（D）；計算肺組織W/D。

1.3.4 大鼠肺組織病理學觀察將左肺上葉組織置于4%多聚甲醛中固定24 h 后切成5 μm 的石蠟切片，HE 染色后光鏡下觀察肺組織病理形態變化。

1.3.5 大鼠肺組織MPO 測定切取大鼠肺組織相應部位0.5 × 0.5 × 0.5 cm3稱重，加入肺組織10倍重的生理鹽水，置入勻漿器中在冰水中勻漿。再以4 000 r/min 離心5 min，分別吸取0.1 mL 上清液按照MPO 測定試劑盒提供的方法測定MPO含量。

1.3.6 Western blot 檢測大鼠肺組織強啡肽、κ 受體、IL-17表達取大鼠肺組織100 mg/份，勻漿后加入適量組織蛋白裂解液，離心后吸取上清，按照BCA 蛋白定量試劑盒操作。樣品經15%SDS-PAGE分離后，轉移于硝酸纖維素膜上。以1∶1 000 的兔抗大鼠強啡肽、κ 受體、IL-17 單克隆一抗4 ℃靜置孵育過夜，再以1∶15 000 過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗室溫孵育2 h，用ECL 試劑盒發光顯影，同時檢測GAPDH 的表達作為內參對照。圖像經掃描儀掃描，重復3 次。采用凝膠圖像分析系統檢測蛋白質跡條帶灰度，測定并計算強啡肽、κ 受體、IL-17 與GAPDH 表達灰度的比值。

1.4 統計學方法采用SPSS 13.0 軟件行方差分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，采用方差分析和LSD-t檢驗進行統計學處理。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠動脈血氣分析及肺組織濕/干重比值與模型組比較，迷走神經電刺激組、納美芬組的濕/干重比值、動脈血pCO2值均顯著降低，動脈血pO2值顯著升高（P＜0.01）。與迷走神經電刺激組比較，納美芬組濕/干重比值、動脈血pCO2值、pO2值差異均無統計學意義（P＞0.05）。與納美芬組、迷走神經電刺激組比較，納美芬+迷走神經電刺激組濕/干重比值、pCO2值均顯著降低，pO2值顯著升高（P＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠動脈血氣分析及肺組織濕/干重比值Tab.1 Arterial blood gas analysis and lung tissue wet/dry weight ratio

表1 各組大鼠動脈血氣分析及肺組織濕/干重比值Tab.1 Arterial blood gas analysis and lung tissue wet/dry weight ratio

注：與模型組比較，aP ＜0.01；與迷走神經電刺激組比較，bP ＞0.05，cP ＜0.01；與納美芬組比較，dP ＜0.01

2.2 大鼠肺組織病理變化模型組、迷走神經電刺激組、納美芬組、納美芬+迷走神經電刺激組均可見肺泡間隔破壞，部分肺泡萎陷，肺間質水腫明顯、見炎癥細胞浸潤和紅細胞滲出。假手術肺組織結構完整清晰，肺泡腔內無炎癥細胞浸潤，肺間質無滲出。在病變程度和病變范圍上，納美芬+迷走神經電刺激組比迷走神經電刺激組、納美芬組明顯減輕（圖1）。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化（HE×100）Fig.1 Pathological changes of lung tissue in each group（HE×100）

2.3 大鼠肺組織MPO 水平與模型組比較，迷走神經電刺激組、納美芬組MPO 表達顯著降低（P＜0.01）；與迷走神經電刺激組比較，納美芬組MPO表達差異無統計學意義（P＞0.05）。與納美芬組、迷走神經電刺激組比較，納美芬+迷走神經電刺激組MPO 表達均顯著降低（P＜0.01），見表2。

2.4 大鼠肺組織強啡肽、κ受體、IL-17表達水平與模型組比較，納美芬組強啡肽、κ 受體、IL-17表達均顯著降低（P＜0.01），而迷走神經電刺激組強啡肽、κ 受體表達差異無統計學意義（P＞0.05）、IL-17 表達顯著降低（P＜0.01）。與迷走神經電刺激組比較，納美芬組強啡肽、κ 受體表達均顯著降低（P＜0.01）、IL-17 表達差異無統計學意義（P＞0.05）。與納美芬組、迷走神經電刺激組比較，納美芬+迷走神經電刺激組強啡肽、κ 受體、IL-17 表達均顯著降低（P＜0.01），見圖2、表2。

圖2 各組大鼠肺組織強啡肽、κ 受體和IL-17 表達（Western blot）Fig.2 Expression of dynorphin，κ-receptor and IL-17 in lung tissue of rats in each group（Western blot）

表2 各組大鼠肺組織強啡肽及MPO、κ 受體、IL-17 表達水平Tab.2 Expression of dynorphin and MPO、κ-receptor and IL-17 in lung tissue of each group

表2 各組大鼠肺組織強啡肽及MPO、κ 受體、IL-17 表達水平Tab.2 Expression of dynorphin and MPO、κ-receptor and IL-17 in lung tissue of each group

注：與模型組比較，aP ＞0.05，bP ＜0.01；與迷走神經電刺激組比較，cP ＜0.01，dP ＞0.05；與納美芬組比較，eP ＜0.01

3 討論

阿片肽與其受體的相互作用在炎癥反應中發揮重要作用［8-9］。強啡肽是目前已知的活力最強的內源性阿片肽，是κ 阿片受體的內源性配體［10］。研究表明阿片肽與肺泡細胞表面受體結合后可誘導細胞凋亡，導致肺泡—毛細血管網狀結構通透性增高、肺間質水腫［11］。阿片肽物質與免疫細胞表面特定阿片肽受體結合后能誘導炎癥細胞活化增殖、釋放IL-17 等炎性細胞因子導致細胞損傷［12］。MPO是多型核粒細胞的一種標志性酶，其活性和組織中中性粒細胞的浸潤程度成正比，是反映中性粒細胞浸潤的可靠指標［13］。IL-17 是一種強有力的中性粒細胞趨化及激活因子，可早期特異性地出現在炎癥部位［14］，在肺組織炎癥啟動中發揮主要作用。在急性肺組織損傷過程中，IL-17可趨化巨噬細胞、中性粒細胞大量聚集、誘導炎癥反應發生導致肺組織損傷，同時隨著肺組織損傷加重，肺組織中IL-17 表達明顯升高［15］。本研究發現肺缺血-再灌注損傷組大鼠肺泡組織炎癥反應（表現為MPO、IL-17 表達水平明顯升高）、肺功能損害（表現為動脈血pO2值下降、pCO2值升高）明顯加重，而肺組織中強啡肽及κ 受體表達水平亦明顯升高，表明肺組織中強啡肽與受體相互作用在肺缺血-再灌注損傷后介導粒細胞浸潤、促進炎癥反應過程中發揮重要作用。納美芬作為阿片肽受體拮抗劑可加速阿片肽物質降解，經納美芬處理后，肺組織中強啡肽水平明顯降低，κ 受體表達水平也隨之下降，炎癥反應程度亦明顯減輕，推測納美芬抑制肺缺血-再灌注損傷的作用機制可能與加速強啡肽降解、抑制κ 受體表達水平，減輕炎癥反應有關。體內膽堿能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP）將神經系統和免疫系統緊密聯系起來［16-17］。迷走神經激活后傳出纖維釋放乙酰膽堿，直接或間接地作用于肺泡巨噬細胞的表面的α7n ACh R（膽堿能受體）［18］，抑制NF-κB等信號通路的轉導，降低炎癥因子的表達來減輕炎癥反應。既往研究表明迷走神經電刺激釋放乙酰膽堿可以降低IL-6 等炎性因子的表達從而控制炎癥的級聯反應，減輕肺組織損傷［19-20］。給予迷走神經電刺激后，肺組織中強啡肽及κ 受體表達水平無顯著變化，但炎癥反應程度明顯減輕（MPO、IL-17 表達水平明顯降低），推測迷走神經電刺激可能通過CAP 來減輕缺血-再灌注損傷時肺組織中的炎癥反應。將迷走神經電刺激和納美芬聯合應用后，肺組織中強啡肽及κ 受體表達水平、炎癥反應程度較之單獨應用納美芬出現明顯下降，表明聯合應用迷走神經電刺激可以增強納美芬降解強啡肽、抑制炎癥反應的作用，推測肺組織內膽堿能抗炎通路與阿片肽—受體炎癥通路可能存在交叉、級聯反應，具體過程尚需進一步研究。本研究表明迷走神經電刺激與納美芬聯合應用于防治肺缺血-再灌注損傷可產生協同、增效作用，鑒于目前國外已出現體表外的頸部迷走神經電刺激儀器［20］，若能在臨床上將物理療法與藥物治療結合起來，多種方式聯合應用防治肺缺血-再灌注損傷，有利于克服單一療法的效果局限，發揮各自優勢，其應用前景將進一步廣闊。