腫瘤抑制候選基因-7、叉頭框轉錄因子M1、鱗狀細胞癌抗原在食管癌中的表達及意義分析

王艷玲，楊存敏，李海霞

(河北北方學院附屬第一醫院，河北 張家口 075000)

食管癌作為常見消化道惡性腫瘤，主要可分為食管鱗狀細胞癌、食管腺癌兩類，相關報道指出，歐美國家以后者發病較為多見，而國內主要以食管鱗狀細胞癌較為多見[1～3]。目前大部分食管鱗癌患者在初次確診時病情已進展至中晚期，相關治療措施實施較晚，導致患者在5年內生存期情況不佳[4]。相關研究顯示，在腫瘤患者病灶組織及體液內存在大量長鏈非編碼RNA(IncRNA)，可作為促癌或促癌基因調控腫瘤下游基因蛋白表達，參與胃癌、腸癌、膀胱癌、食管癌等多種惡性腫瘤侵襲轉移，其中腫瘤抑制候選基因-7(TUSC7)在癌組織中呈現低表達狀態[5]，可促進細胞凋亡，亦可通過與miR-211、p53等抑癌因子相結合加速腫瘤進展。此外，叉頭框轉錄因子M1(Foxm1)、鱗狀細胞癌抗原(SCC-Ag)在一系列惡性鱗狀細胞癌中呈現高表達狀態[6，7]，可參與部分肺癌、宮頸癌的早期診斷，反映腫瘤進展情況。本研究探討LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag在不同分期食管癌患者中的表達情況及意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2019年1月至2020年6月我院收治的78例食管癌患者，納入標準：①經病理檢查、食管鋇餐、胃鏡等方式確診為原發性食管癌者；②均接受本次研究所涉及指標的檢查。排除標準：①合并其他類型腫瘤者；②臨床資料保存不完整者。根據腫瘤分期分為早中期組(TNM分期Ⅰ～Ⅱ期)32例與中晚期組(TNM分期Ⅲ～Ⅳ期)46例。男46例，女32例；年齡37～75歲[(53.63±9.52)歲]；TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期22例，Ⅲ期35例，Ⅳ期11例；78例均為鱗癌。

1.2 方法收集癌組織標本，對食管鱗癌細胞株及正常食管上皮細胞進行細胞培養，以10%胎牛血清、1%雙抗RPIM 1640完全培養液在5%CO2、37 ℃條件下的細胞培養箱內實施培養。①TUSC7基因序列依據美國國立生物技術信息中心(NCBI)相關記錄獲得[8]，設計擴增引物；②采用Trizol法、血清RNA提取法對食管鱗癌細胞株及血清中總RNA進行測定，通過電泳法對RNA完整度進行檢測；③采用核酸蛋白測定儀對RNA濃度進行測定，篩選A260/280值在1.8～2.1、總RNA濃度在210 ng/μl以上的良好樣本于-80 ℃下進行保存；④采用Primer premier 5.0軟件進行引物設計；⑤將RNA逆轉錄為cDNA，并于-20 ℃下保存，qPCR擴增過程中需以Gapdh作為內參，cDNA作為模板，反應參數設置為95 ℃預變性1 min、95 ℃10 s、64 ℃30 s、72 ℃30 s共40個循環，并于72 ℃下進行5 min延伸；⑥采用2-△△Ct相對定量法測定TUSC7基因相對表達值；⑦Foxm1水平測定采用上述相同RNA濃度測定方法及引物設計軟件，將β-actin作為內參，反應參數設置為95 ℃預變性2 min、95 ℃15 s、60 ℃45 s共40個循環；⑧采用2-△△Ct相對定量法計算基因表達值。同時采集所有患者外周靜脈血5 ml，采用全自動生化分析儀對SCC-Ag水平進行測定。

1.3 觀察指標比較兩組LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表達水平；分析其表達水平與腫瘤分期的相關性；評估三項指標對食管癌患者腫瘤分期評估效能。

1.4 統計學方法采用SPSS 21.0軟件分析數據。計量資料比較采用t檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析；診斷效能分析采用ROC曲線。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表達水平比較中晚期組LncRNATUSC7水平低于早中期組，Foxm1、SCC-Ag水平高于早中期組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表達水平比較

2.2 LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表達水平與食管癌腫瘤分期的相關性LncRNATUSC7水平與食管癌腫瘤分期呈負相關，Foxm1、SCC-Ag水平與食管癌腫瘤分期呈正相關(P<0.05)，見表2。

表2 LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表達水平與食管癌腫瘤分期的相關性

2.3 LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表達水平評估食管癌分期的效能分析LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表達水平評估食管癌分期的ROC曲線AUC分別為0.914、0.871、0.795，截斷值分別為0.27、1.40、5.15 ng/ml，見圖1、表3。

圖1 LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表達水平評估食管癌分期的ROC曲線

表3 LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表達水平評估食管癌分期的效能分析

3 討論

食管鱗癌屬于侵襲性惡性腫瘤，臨床針對病情發現較晚的患者可借助手術、放射治療、輔助化療、生物治療等手段實施治療，但因腫瘤侵襲較快，易發生食道內播散、淋巴轉移、血行轉移及手術切口轉移[9，10]，治療情況不佳，五年內生存情況堪憂，故探尋評估腫瘤侵襲進展情況的指標極為必要。

上皮細胞間質轉型(EMT)與腫瘤細胞侵襲轉移存在緊密關聯，在EMT進展過程中，機體上皮細胞可喪失E-cadherin等連接蛋白，并補充Vimentin、Ncadherin等間充質標志蛋白。而近年來相關研究指出，IncRNA可通過對EMT過程的調節參與而參與部分腫瘤的發生發展，其促癌、抑癌基因共同發揮作用，參與腫瘤侵襲轉移[11]。LncRNATUSC7位處染色體3q13.31，由4個外顯子共同組成，屬于一類反義lncRNA，在骨肉瘤、非小細胞肺癌、胃癌、胰腺導管腺癌等多種惡性腫瘤組織中TUSC7均呈低表達狀態[12，13]，與腫瘤生長情況及惡性腫瘤的臨床病例特征及預后密切相關。本研究中，中晚期組LncRNATUSC7水平顯著低于早中期組，LncRNATUSC7水平與食管癌腫瘤分期呈負相關，提示隨著食管癌患者腫瘤分期的進展，其LncRNATUSC7多呈現低表達。而ROC曲線進一步證實其在食管癌分期評估中具有良好效能，這可能與LncRNATUSC7過度結合miR-211、miR-23b、miR-224、miR-10a等抑癌基因進而加速EMT進程有關。隨著抑癌基因及TUSC7水平的共同降低，腫瘤侵襲轉移情況進一步促進。此外，LncRNATUSC7表達的降低可引起Vimentin、Ncadherin等蛋白表達水平的上調，同時下調E-cadherin連接蛋白表達，亦可促進EMT進程，使腫瘤遷移進展情況得到促進。

叉頭框(FOX)蛋白轉錄因子家族存在多個亞族，其蛋白成員作為轉錄因子可憑借對共激活因子的招募對基因轉錄產生調節作用，部分家族成員可結合凝聚染色質，并參與其重構及轉錄調節。FOXM1作為FOX轉錄因子家族中的一員，可協同其他成員分別參與調節細胞分化、增殖、代謝、凋亡等多種重要的生理過程，近年來相關研究指出，FOXM1在肺鱗癌等多種鱗癌中呈現高表達狀態，其表達量與腫瘤良惡性、細胞分化程度具有先顯著相關性[14]。SCC-Ag作為一類鱗狀細胞相關抗原，被指出在多種鱗癌患者血清中呈現高表達狀態[15]。本研究中，中晚期組Foxm1、SCC-Ag水平高于早中期組，Foxm1、SCC-Ag水平與食管癌患者腫瘤分期呈正相關，提示隨著腫瘤分期的進展，食管癌患者Foxm1、SCC-Ag水平多呈現更高表達狀態。ROC曲線分析進一步確認了二者在食管癌患者腫瘤分期中的評估效能，分析其原因在于FOXM1屬于一類具備細胞生長調節功能的轉錄因子，在正常表達情況下可憑借多種基因轉錄對細胞有序分裂進行調控，在其表達水平顯著升高后，細胞基因組紊亂程度明顯提升，從而導致細胞基因突變風險上升。此外，FOXM1可發揮對血小板源性生長因子-A的反式激活作用，使血小板衍生生長因子受體信號通路激活，并借助該通路參與EMT過程，減少腫瘤細胞凋亡，并促進其增殖轉移。而SCC-Ag來源于鱗狀上皮細胞癌組織，隨著機體癌組織的生長其表達水平亦可明顯上升。