淫羊藿苷改善大鼠勃起功能障礙及大鼠陰莖海綿體纖維化程度研究

劉思巧，姚俊成，顏 天，王 磊，李玉濤，楊 祺，竇 科

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院東院泌尿外科，四川 成都 610000)

勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)是患者無法正常勃起的疾病[1]。ED的患病率在全球呈現上升趨勢[2]。多種因素與ED發生相關[3]。由于勃起過程主要由充血引起，血管性因素仍是ED發生中最重要的因素[4]。而在血管性ED的情況下，由于血流灌注減少，造成陰莖海綿體內血管及其周圍組織破壞[5]。淫羊藿是淫羊藿屬植物全草，在中國傳統醫學中，具有補腎陽的功用，其在人體中的主要活性成分是淫羊藿苷[6]。淫羊藿苷在人體內發揮多種作用[7～9]，包括改善組織纖維化程度[10]。為了確認ED發生時海綿體是否發生纖維化程度的增加，以及淫羊藿苷是否能改善海綿體纖維化，我們設計了本次實驗。

1 資料與方法

1.1 一般資料2020年10月至2021年2月在四川省人民醫院飼養的60只雄性SD大鼠，年齡8周，體重250～300 g，其飼料、飲水、飼養環境相同。實驗器械：成都儀器廠產多通道生理記錄儀，型號RM-6240E；匈牙利3DHISTECH公司生產數字切片掃描儀，型號Pannoramic 250；常州派斯杰醫療設備公司生產的全自動染色儀，型號RS36。

1.2 方法將60只SD大鼠通過簡單隨機抽樣分為假手術組、模型組、他達拉非組及淫羊藿苷低、中、高劑量組各10只。除假手術組外，其余5組均采取結扎雙側髂內動脈的方式構建血管性ED大鼠模型[11]，在對大鼠麻醉滿意后進入腹腔，尋找雙側髂內動脈后以絲線結扎其近端。假手術組僅在麻醉滿意后進入腹腔，翻找查看雙側髂內動脈后，不作任何處理即縫合腹腔。完成手術后，對不同組大鼠給予不同的藥物處理。其中假手術組和模型組不予藥物處理，僅給予1 ml/d的生理鹽水灌胃；他達拉非組給予0.8 mg/kg的他達拉非灌胃；低劑量組給予20 mg/kg的淫羊藿苷飼喂，中劑量組給予40 mg/kg的淫羊藿苷飼喂，高劑量組給予80 mg/kg的淫羊藿苷飼喂。以上飼喂連續持續30天。飼喂結束后，測量大鼠最大陰莖海綿體內壓(ICPmax)后取得大鼠陰莖海綿體標本，對大鼠陰莖海綿體進行冷凍后切片，每份標本取得3份切片利用masson染色的方式對切片進行染色。染色包括脫蠟、固定液固定后，利用苯胺藍染色液染色、蘇木素染色液、麗春紅品紅染色液、天青石藍染色液，隨后利用磷鉬酸溶液顯色和弱酸性溶液酸化。染色結束后利用數字切片掃描儀對切片進行圖像采集。

1.3 觀察指標①ICPmax：作為測量大鼠勃起功能的指標。通過26G針頭刺入大鼠陰莖海綿體根部時電刺激大鼠海綿體神經取得[12]。②纖維組織表達面積百分比：大鼠陰莖海綿體纖維組織表達面積百分比作為反映大鼠陰莖海綿體纖維化程度的指標。通過masson染色后數字掃描切片得到。

1.4 統計學方法采用GraphPad Prism 5.0系統。計量資料多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Tukey分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠勃起功能比較假手術組、他達拉非組、中劑量組、高劑量組高于模型組(P<0.001)；高劑量組高于他達拉非組(P<0.01)；低劑量組與模型組、高劑量組與假手術組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠ICPmax值比較

2.2 各組大鼠陰莖海綿體纖維化程度比較采用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統，對取得的大鼠陰莖海綿體切片標本進行測圖像的光密度(IOD)和面積測定，計算纖維組織表達面積百分比。模型組陰莖海綿體纖維組織表達面積顯著大于假手術組(P<0.05)。通過對6組大鼠的陰莖海綿體纖維組織表達百分比進行比較，模型組大于假手術組(P<0.05)，其余組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠陰莖海綿體纖維組織表達面積百分比比較 (%)

2.3 各組大鼠陰莖海綿體切片鏡下觀察通過40倍鏡下觀察，可見假手術組大鼠陰莖海綿體內膠原纖維組織疏松，染色樣本光密度小(圖1a)；模型組大鼠陰莖海綿體內膠原纖維交聯非常致密，占據視野中的絕大部分(圖1b)；他拉達非組大鼠陰莖海綿體內膠原纖維較疏松，染色樣本光密度較小(圖2a)；低劑量組大鼠陰莖海綿體內膠原纖維較致密，染色樣本光密度大(圖2b)；中劑量組大鼠陰莖海綿體內膠原纖維較疏松，纖維交聯較疏松(圖3a)；高劑量組大鼠陰莖海綿體內膠原纖維疏松，組織間隙大，染色樣本光密度較小(圖3b)。

圖1 假手術組和模型組大鼠陰莖海綿體40倍鏡下病理特征 a：假手術組；b：模型組

圖2 他達拉非組和低劑量組大鼠陰莖海綿體40倍鏡下病理特征 a：他達拉非組；b：低劑量組

圖3 中劑量組和高劑量組大鼠陰莖海綿體40倍鏡下病理特征 a：中劑量組；b：高劑量組

3 討論

通過傳統中藥淫羊藿臨床上對于治療ED的啟發，本文對于淫羊藿苷的活性成分淫羊藿苷在大鼠體內的作用做出了探究。通過查閱文獻資料，確定了以雙側髂內動脈結扎的方式構造大鼠血管性ED模型，作為后續研究的基礎。大鼠血管性ED模型也通過測量大鼠陰莖海綿體內壓的方式得到驗證。在后續的工作中，通過查閱文獻確定了不同組別大鼠的藥物飼喂濃度，并選擇他達拉非這一臨床常用改善勃起功能的藥物作為陽性對照，作為后續治療效果和機制的比較。通過對大鼠ICPmax的測量，可以對不同組大鼠的勃起功能進行比較。其結果可以提示，雙側髂內動脈結扎后大鼠的勃起功能顯著降低，而他達拉非、中劑量淫羊藿苷、高劑量淫羊藿苷對于大鼠的勃起功能有顯著的改善作用，低劑量淫羊藿苷對于大鼠的勃起功能改善效果不明顯，而高劑量淫羊藿苷對于大鼠勃起功能的改善效果優于他達拉非。在進行大鼠陰莖海綿體纖維化程度的測量過程中，可以發現雙側髂內動脈結扎后，大鼠陰莖海綿體的纖維化程度顯著增加，提示動脈灌注的減少能夠導致海綿體纖維化增加，從而進一步限制血管的充盈和勃起的發生，為ED的發生和發展提供了新的思路。通過30天的藥物飼喂，可以發現不同組別大鼠的陰莖海綿體纖維化程度存在一定的分布趨勢，這一分布主要呈現為假手術組<高劑量組<他達拉非組<中劑量組<低劑量組<模型組。但通過兩兩比較，發現除假手術組與模型組之間的差別顯著以外，其余的組間比較不具有明顯的差別。這一差別可能與本次實驗中對大鼠的灌藥處理的方式和時間不同有關。通過查閱文獻，可以發現在淫羊藿苷改善大鼠肝臟纖維化的實驗中，其飼喂時間長達8周[13]。而在淫羊藿苷改善大鼠腎臟纖維化的實驗中，采取了對大鼠進行淫羊藿苷靜脈注射的方式給藥，以達到更高的血藥濃度[14]。因此，本實驗藥物處理時間較短，攝入方式需代謝轉換，可能是導致本實驗中能觀察到淫羊藿苷在不同劑量組減少了陰莖海綿體纖維化的程度，但結果不顯著的原因。在后續實驗中，為探索淫羊藿苷對于大鼠陰莖海綿體有無去纖維化的作用，可適當延長飼喂淫羊藿苷的時間，在保證大鼠勃起功能不受衰老影響的前提下，進一步說明淫羊藿苷對大鼠海綿體纖維化的作用。

綜上所述，雙側髂內動脈結扎能夠顯著破壞大鼠勃起功能；他達拉非灌胃和中劑量及高劑量淫羊藿苷灌胃能夠顯著改善血管性ED大鼠勃起功能；高劑量淫羊藿苷改善血管性ED大鼠勃起功能的效果，顯著優于他達拉非改善血管性ED大鼠勃起功能的效果。模型組大鼠陰莖海綿體纖維組織面積顯著大于假手術組陰莖海綿體纖維組織面積，提示雙側髂內動脈結扎后，陰莖海綿體內由于動脈灌注不足，可以造成陰莖海綿體的纖維組織增加，對ED的發病過程提出新的解釋。他達拉非和各劑量淫羊藿苷的作用可以使得大鼠陰莖海綿體纖維面積不同程度下降，但效果不顯著。