高效液相色譜-串聯質譜法測定茶葉中赤霉素的研究

鄧六愛，劉 峰，張念英，郭 冰，禚歡歡

（日照市市場監管檢驗檢測中心，山東 日照 276800）

生長調節劑是一類能對植物生長起調節作用的活性物質[1]。赤霉素是較常見的一種植物生長調節劑，在植物生長和發育中發揮著重要的調節作用[2]。茶樹是一種以收獲幼嫩葉芽為主的多年生經濟作物，茶樹春梢萌動越早，春茶生產時段越長，產生的經濟效益就越大。赤霉素可以打破嫩芽冬眠，促進新梢萌發及嫩芽生長，提高茶葉產量[3-4]。目前，茶園中廣泛使用赤霉素，盡管赤霉素毒性不大，但長期大量不合理使用也會在人體器官中蓄積，造成慢性中毒[5]。歐盟規定赤霉素的最高殘留限量值（MRL）為5 mg/kg。我國目前尚未制定茶葉中赤霉素的最大殘留限量[6-10]。

目前國內外檢測赤霉素的方法有毛細管氣相色譜法[11]、高效液相色譜法[12-13]、氣質聯用法、酶聯免疫法[14]、高效液相色譜-串聯質譜法[15-17]等。有些前處理較為繁瑣，有些方法靈敏度低，存在操作復雜、環境不友好等缺點。但是，對茶葉中赤霉素檢測方法未見相關文獻報道。試驗建立了超高壓液相色譜－串聯質譜分析茶葉中赤霉素含量的檢測方法，操作簡單快速、可靠準確，為開展茶葉中赤霉素的安全性研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

QTrap4500型高效液相色譜-質譜聯用儀，美國SCIEX公司產品；3-18KS型高速冷凍離心機，德國SIGMA公司產品；EVAP-45型水浴氮氣吹干儀，美國Organomation公司產品；KQ-500DE型數控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品；IKA MS3 basic型高速均質儀，德國IKA公司產品；XPE205型分析天平（梅特勒感量0.01 mg）；ME1002E型分析天平（梅特勒感量0.01 g）。

標準品：赤霉素（純度97.9%），德國Dr.Ehrenstorfer公司提供；甲醇（色譜純，CNW）、乙腈（色譜純，CNW）、甲酸（色譜純，CNW）、HC-C18、PSA，GCB，其他試劑為分析純；所有試驗用水為一級水。

1.2 液相色譜-串聯質譜條件

色譜柱：Xbridge C18柱，2.1 mm×150 mm，3.5 μm；流速0.20 mL/min，進樣量10 μL，柱溫40℃。

流動相：梯度洗脫；5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）（A）和乙腈（B），梯度洗脫程序：0min，A為95%，B為5%；2min，A為95%，B為5%；2.1min，A為90%，B為10%；8.0min，A為20%，B為80%；10.0min，A為20%，B為80%；10.1min，A為95%，B為5%；12min，A為95%，B為5%。

質譜條件：電噴霧ESI離子源，離子源溫度550℃；采用負離子（ESI-）采集模式，多反應監測（MRM）方法測定；離子噴霧電壓4.5 kV；霧化氣、氣簾氣、碰撞氣均為高純氮氣，使用前調節各氣體流量，以使質譜靈敏度達到檢測要求。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

準確稱量赤霉素標準品25 mg于25 mL容量瓶中，用色譜純甲醇溶解，定容至25 mL，配制成1 000 μg/mL的赤霉素標準儲備液，置于-20℃的冰箱中保存。再以甲醇逐級稀釋成100.0，10.0，1.0 μg/mL的赤霉素標準中間液。取適量的赤霉素標準中間液，以0.1%甲酸乙腈（1∶1）溶液為稀釋溶劑配制成10，20，50，100，200 ng/mL的混合標準工作液。取空白樣品，經1.3.1處理至氮吹近干后，加入1.00 mL混合標準溶液，制備成基質標準工作溶液，現用現配。

1.3.2 標準曲線的制作

準確稱取10 g經粉碎后備茶葉（準確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加入20 mL含1%甲酸的乙腈溶液，渦旋2 min，超聲提取15 min，以轉速10 000 r/min離心5 min，取上清液轉移至離心管中。再分別用10 mL含1%甲酸的乙腈溶液提取2次，合并上清液。上清液中加入4 g無水硫酸鎂和1 g無水乙酸鈉，立即渦旋混合1 min，以轉速10 000 r/min離心5 min。

精密量取上層乙腈溶液8 mL置于15 mL離心管中（含400 mg無水硫酸鎂和120 mg HC-C18），渦旋2 min，以轉速10 000 r/min離心5 min。取上清液于15 mL試管中，于45℃水浴中氮吹至近干，以1.00 mL甲酸-乙腈（1∶1）定容。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法優化

2.1.1 提取溶劑的選擇

由于赤霉素難溶于水，參考文獻表明采用甲醇和乙腈作為提取溶劑時，甲醇提取效果及回收率不理想，乙腈提取效果明顯提高。因此，優先考慮使用乙腈作為提取溶劑。根據赤霉素的分子結構和化學性質，酸化乙腈更有利于赤霉素的提取。試驗分別考查了純乙腈、1.0%甲酸乙腈、1.0%乙酸乙腈3種提取溶劑對赤霉素的提取效果。

結果表明，采用純乙腈提取回收率低，難以滿足檢測要求。赤霉素中含有羧基，受pH值影響較大，酸性條件能抑制羧基在溶液中電離成離子形態，保持分子狀態更有利于提取。采用1.0%的酸化乙腈，鮮葉和干茶中赤霉素的提取效果均有所改善，1.0%的甲酸乙腈效果好于1.0%乙酸乙腈。試驗同時考查乙腈中加入0.1%，0.5%，1.0%甲酸對赤霉素的提取影響。當在乙腈中加入1.0%的甲酸，回收率大于90%，明顯優于其他2種提取溶劑。因此，試驗最終選用1.0%的甲酸乙腈溶液進行鮮葉和干茶中赤霉素的提取。

不同提取溶劑茶葉中赤霉素回收率見表1。

表1 不同提取溶劑茶葉中赤霉素回收率

2.1.2 提取溶劑用量和提取條件的選擇

茶葉基質復雜，提取條件需要使基質干擾最小并且能有效提取目標物。結果表明，采用30 mL 1.0%甲酸乙腈溶液提取時，提取溶劑用量不夠，回收率偏低。采用1.0%甲酸乙腈50 mL與1.0%甲酸乙腈溶液40 mL提取，回收率相差不大。乙腈具有一定的毒性，本著有機溶劑用量少、保護環境的原則選用1.0%甲酸乙腈溶液40 mL進行提取。超聲提取次數的不同，可能會直接影響目標物提取效率。研究表明，1次提取不完全，回收率偏低；2次提取，回收率約至80%以上，基本達到試驗目的。但目標物添加含量高（100 μg/kg）時回收率降至60%左右，存在提取不完全現象。綜合考慮，采用3次提取，鮮葉和干茶回收率均可提高至95%以上。

不同提取條件茶葉中赤霉素回收率見圖1。

圖1 不同提取條件茶葉中赤霉素回收率

2.1.3 吸附劑的選擇

液液萃取法、QuEChERS法、固相萃取小柱法等是常用凈化的手段[17]。QuEChERS法簡單快速，一般先在提取液中加入一定量的無水硫酸鎂、無水乙酸鈉等去除水分和水溶性雜質，促進待測物向乙腈溶液中轉移。然后加入一定量的分散固相萃取劑，如十八烷基硅烷C18粉、N-丙基乙二胺PSA粉、石墨化碳黑GCB粉，以達到除雜凈化的作用。

不同吸附凈化劑的作用機理不同，試驗分別考查離子交換劑（PSA）、惰性吸附劑（石墨化炭黑GCB）、廣譜型凈化材料C18這3種常用吸附劑對樣品的凈化效果及回收率的影響。PSA主要作用力是極性相互作用及弱陰離子交換作用，對于脂肪酸、有機酸、有機碳水化合物等極性化合物有較好的吸附作用，因此對帶有羧基結構的赤霉素有很大程度的吸附，明顯影響目標物的回收效果。GCB粉作為吸附凈化劑可用于去除色素等干擾物，但同時對待測物也有明顯的吸附作用，回收率進一步降低。C18具有強非極性作用，對極性較弱的烯烴類、色素等干擾物有較好的吸附效果。試驗采用C18作為吸附劑回收率及凈化效果明顯較好，試驗還同時比較了C18凈化粉的用量，隨著用量的增加，凈化效果顯著提高。在C18粉用量120 mg時，回收率可達90%以上，增加至250 mg時，回收率基本變化不大。因此，選擇C18粉120 mg作為試驗的吸附凈化劑。

不同吸附劑茶葉赤霉素回收率見圖2，C18吸附劑用量對赤霉素回收率的影響見圖3。

圖2 不同吸附劑茶葉赤霉素回收率

圖3 C18吸附劑用量對赤霉素回收率的影響

2.1.4 定容溶劑的優化

為了提高赤霉素高效液相色譜－質譜檢測過程中的靈敏度和色譜峰形，考查了0.1%甲酸乙腈（1∶1）溶液、乙腈、0.1%甲酸水溶液作為定溶溶劑時赤霉素的分離提取效果。結果表明，0.1%甲酸水溶液不能充分復溶目標物導致回收率偏低；采用乙腈作為定容溶劑時，色譜峰分離效果差；采用0.1%甲酸乙腈（1∶1）溶液定容赤霉素色譜峰能夠有效分離，得到滿意的峰型且回收率較高。因此，試驗選用0.1%甲酸乙腈（1∶1）溶液作為定容溶劑。

2.2 流動相優化

流動相對目標物的峰形、靈敏度及分離度有較大的影響。試驗初期，采用甲醇和純水作為流動相，響應偏低、靈敏度不高、重復性差，可能是由于赤霉素在水溶液中不穩定容易分解有關。目前，植物生長調節劑殘留檢測大多應用有機溶劑配合酸類或鹽類物質配比作為流動相。把流動相中的純水換成0.1%甲酸水（V/V），響應和穩定性提高。這是因為赤霉素在酸性條件下穩定，流動相中的酸能促進增強負離子模式下的赤霉素分子離子化的結果。而采用5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）和乙腈作為流動相時，流動相的離子強度進一步增加，目標物質響應值達到理想，響應值及峰形有明顯改善。

2.3 質譜條件優化

赤霉素中含有羧基，采用ESI負離子掃描模式，有利于獲得更好的離子化效率。采0.10 μg/mL的赤霉素標準溶液經真泵注射進樣，得到赤霉素準分子離子峰m/z345.1。以m/z345.1為母離子，通過子離子掃描得到赤霉素子離子主要是m/z239.0和m/z143.0，子離子m/z239.0豐度最大。因此，可以確定質譜分析赤霉素時，定量離子對為m/z345.1>239.0，定性離子對為m/z345.1>239.0，m/z345.1>143.0。然后再對錐孔電壓和毛細管電壓等參數進行優化，使分子離子和特征碎片離子強度達到最大，確定最佳質譜參數。按照試驗確定的條件得到赤霉素標準圖譜。

赤霉素標品色譜圖（100 ng/mL）見附圖4。

圖4 赤霉素標品色譜圖（100 ng/mL）

2.4 工作曲線、線性范圍及檢出限的確認

空白基質樣品前處理后，配制成質量濃度為10.0～800 ng/mL標準基質工作系列，在此范圍內呈線性關系。實際方法驗證過程以10.0～200 ng/mL范圍的標準基質工作溶液為標準系列，以工作液質量濃度為橫坐標、色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到赤霉素的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限、定量限。結果表明，鮮葉赤霉素在10.0～200 ng/mL質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數為0.999 8；干茶赤霉素在10.0～200 ng/mL質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數為0.999 8。采用空白基質中添加目標組分，前處理后上機，信噪比法確定方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。鮮葉中赤霉素的LOD和LOQ為0.99，3.31 μg/kg；干茶中赤霉素的LOD和LOQ為0.26，0.88 μg/kg。

赤霉素的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限（LOD）、定量限（LOQ）見表2。

表2 赤霉素的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限（LOD）、定量限（LOQ）

2.5 準確度和重復性

選用鮮葉與干茶作為空白基質，進行加標回收和精密度試驗。樣品添加量為10，20，100 μg/kg 3個質量濃度標準，每種質量濃度平行測定6次，鮮葉赤霉素加標回收率為80.5%～98.5%，干茶赤霉素加標回收率在85.0%～106.0%，相對標準偏差均小于5%，方法的回收率和精密度滿足檢測要求。因此，該方法適用于茶葉中赤霉素的測定。

茶葉中赤霉素的加標回收率及精密度（n=6）見表3。

表3 茶葉中赤霉素的加標回收率及精密度（n=6）

3 結論

根據赤霉素化學性質，建立了高效液相色譜-串聯質譜檢測茶葉中赤霉素的方法。該方法通過對前處理過程和色譜質譜條件優化，較好地控制了基質干擾，靈敏度高，方法的線性關系、回收率良好，精密度和準確度較高。采用該方法對從市場上隨機購買的春季綠茶樣品進行檢測，含量為0.94～371 μg/kg。適用于茶葉中赤霉素殘留的檢測，具有較高的實際應用價值。