暗場光散射技術在腫瘤標志物檢測中的應用

鄭向江 趙澤娟 滿 意 霍孟田 楊 萍

（山東省腫瘤標志物檢測技術重點實驗室，臨沂大學 化學化工學院，山東 臨沂 276005）

近年來，暗場光散射技術極大地吸引了人們的興趣，被廣泛應用于探測化學反應[1-2]，實時光學傳感[3]，金屬離子的高靈敏度定量[4]，單細胞水平的成像等[5]領域。暗場光散射技術主要基于等離子探針的局域表面共振效應的原理（如圖1），利用暗視野顯微鏡（Dark field microscope,DFM）能夠有效地捕捉探針的散射光信息，一方面靶引發納米顆粒的聚集，引起散射光顏色的改變，可以對特征光點進行計數，建立起與靶標濃度相關的工作曲線，用來對腫瘤標志物靶標進行定量檢測；另一方面與靶標相關的納米顆粒微環境的改變，會影響散射光譜的變化，特別是強度的改變和峰位置的偏移。分析腫瘤標志物靶標與散射光譜變化的關系，也可以達到檢測靶標的目的。[6-8]暗場光散射技術具有非常突出的優點：暗場光散射成像無背景干擾，靶標的細微結構可以突出顯示在成像中，適合顆粒、細胞等小尺度界面的觀測；常用的探針主要是貴金屬納米顆粒，光學性質非常優良，所處環境的輕微改變都能引起等離子光譜強度或者峰位置的改變，有利于對靶標的分析檢測。

圖1 暗場散射成像技術原理圖Fig.1 Schematic diagram of dark field light scattering technology[6]

腫瘤標志物是一類能夠反映腫瘤的存在和生長的物質，是由腫瘤細胞或者腫瘤組織表達合成的，或是機體在腫瘤發生和增殖過程中對腫瘤反應增加的物質。高特異性、高靈敏度檢測腫瘤標志物是實現腫瘤早期診斷的重要手段。本文主要研究暗場光散射技術在腫瘤標志物檢測中的應用，特別是檢測脫氧核糖核酸（DNA）、微小核糖核酸（miRNA）、甲胎蛋白、癌胚抗原等腫瘤標志物，并對基于暗場光散射技術的檢測方法的下一步發展進行展望。

1 暗場光散射技術在DNA檢測中的應用

DNA是生物體內一類攜帶遺傳信息的生物大分子。四種不同堿基的排布序列使DNA成為遺傳信息的載體，來指導合成生物體內的蛋白質。Bu等人通過兩條互補的DNA單鏈，誘導膠體金的聚集沉淀，通過暗場顯微鏡成像來定量DNA，檢測限為100 fM。[9]Guo等人設計了一種Y型DNA雙鏈結構的比色傳感器，誘導膠體金二聚物的形成，可以控制粒子間的距離和粒子聚集的尺寸，大大提高了穩定性。與傳統的比色方法相比，檢測的動態范圍增加了2個數量級，檢測限增加了10000倍。[10]在此工作基礎上，Li等改進了Y型結構的比色傳感器設計，用低成本的單鏈DNA代替昂貴的2-硫乙醚乙酸在材料表面形成致密層，用來不對稱修飾其他的單鏈DNA以形成Y型結構傳感器，引發膠體金二聚體的形成（如圖2）。[11]在暗場顯微鏡下，使用金納米顆粒計數法對靶DNA進行定量，檢測限為43 aM，其靈敏度比傳統比色方法大大提高。同樣采用膠體金計數法，Li等人設計了一種非放大三明治方法對核酸進行檢測，結合磁分離技術，檢測限甚至可以達到10-15 M。[12]Chen等人設計了一種新的比色方法，利用雜交鏈式反應形成的DNA雙鏈引發膠體金的聚集，利用暗場顯微鏡計數定量檢測靶DNA。[13]

圖2 基于Y型結構探針設計暗場檢測DNAFig.2 Detection of DNA based on Y-typestructure probe[11]

2 暗場光散射技術在miRNA檢測中的應用

微小核糖核酸（miRNA）是一類長度約19-25個核苷酸的非編碼RNA。研究表明，miRNA在腫瘤細胞和正常細胞中的表達存在著明顯的差異，大部分的miRNA基因位于與腫瘤形成相關的基因位點上，由此表明miRNA可能在腫瘤的發生或者生長階段發揮關鍵作用。比如：miR-21在胃癌等惡性腫瘤中表達豐富；miR-17-92在小細胞肺癌生長過程中起關鍵的作用；miR-122a常見于正常的肝臟組織中，但是在肝癌中的表達明顯降低等。

Hwu等人發展了一種基于暗場微井的方法來檢測緩沖溶液和細胞裂解液中的miRNA，高通量傳感，能夠即時檢測。[14]Xu等人發展了一種基于催化發卡組裝、雜交鏈式反應和金—銀納米探針刻蝕的高靈敏度方法來檢測miRNA-141。miRNA-141能夠引發催化發卡組裝和雜交鏈式反應，促使模擬辣根過氧化物酶的形成，能夠使雙氧水分解為羥基自由基，來刻蝕金納米顆粒的銀殼。由此產生的表面等離子體吸附和散射效應可以用于miRNA-141的定量依據，檢測限低至50 aM。[15]Zhou等人發展了一種新的顏色分析方法來區分單個金納米顆粒，極大地改進了圖像的顏色分辨率和檢測的靈敏度，用來檢測與肝腫瘤細胞相關的miRNA。[16]Long等人設計了一個單細胞中同時進行miRNA-21靶向成像和光熱治療的體系。如圖3，miRNA-21誘導金納米顆粒聚集，在暗場顯微鏡下成像，并且吸收峰移至近紅外光區。近紅外光照射殺死MCF-7癌細胞。[17]

圖3 (a)miRNA-21誘導金納米顆粒聚集和熒光開關；（b）miRNA-21原位成像和miRNA靶向近紅外治療

3 暗場光散射技術在蛋白類標志物檢測中的應用

常見的屬于蛋白類的腫瘤標志物有癌胚抗原、核仁素、甲胎蛋白、堿性磷酸酶、p53蛋白等。

癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是一種適用范圍廣泛的腫瘤標志物，主要位于內胚層分化的惡性腫瘤細胞表面。CEA雖然不能作為腫瘤診斷的特征參數，但具有較高的臨床意義。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是一種單一的糖蛋白，在正常情況下由胎兒的卵黃囊及肝細胞合成。一般情況下，正常人的甲胎蛋白值不會升高，但肝癌患者的甲胎蛋白值往往是顯著升高的，所以臨床上常用AFP來進行肝癌的早期篩查。前列腺特異抗原（prostate specific antigen，PSA）是前列腺上皮細胞分泌的一種蛋白。正常人血清中含量極微。在腫瘤或者炎癥的情況下，前列腺的結構受到破壞，導致血液中的PSA升高，可用于前列腺癌的診療監測。

Ma等人基于三明治免疫分析方法，設計了兩種納米探針，同時對AFP和CEA進行暗視野成像（如圖4）。AFP抗體結合的金納米顆粒和CEA結合的銀納米顆粒在暗視野顯微鏡下顯示不同的顏色，因此可以利用計數法對AFP和CEA進行同時定量。分析表明，兩種靶標在一定濃度范圍內（0.5-10 ng/mL）相互沒有干擾，表明了雙靶同時靈敏檢測的實用性[18]。Poon等基于貴金屬納米粒子間的等離子體耦合效應，設計了一種簡單而有效的腫瘤標志物定量檢測的方法。[19]將金納米顆粒和銀納米顆粒作為捕獲探針和信號探針，分別修飾了一級抗體和二級抗體。在相應靶存在下，能夠形成夾心結構的免疫復合物，大大增強了散射強度。用暗場顯微鏡光譜系統測定粒子的強度變化，來確定腫瘤標志物的濃度。測定了三種類型的標志物，包括CEA、AFP和PSA，測定的檢測限分別為7.0 pM、3.3 pM和5.9 pM，0到300 pM范圍內存在線性關系。與傳統檢測方法進行數據對比，呈現了較好的一致性。Wu等人也發展了一種檢測腫瘤標志物的方法。設計使用鏈霉親合素功能化的磁珠和二抗功能化的金納米顆粒作為低成本和通用的免疫平臺。PSA、CEA和AFP的檢測限分別為1.0、5.0和1.0 ng/mL。[20]

圖4 在DFM下同時測定AFP和CEA的原理圖Fig.4 Schematic diagram of simultaneousdetermination of AFPand CEA[18]

核仁素(nucleolin，NCL)是在核仁中高度表達的一種蛋白，參與很多生物學過程，并能夠與多種致癌基因作用，從而影響細胞的生長和增殖等。核仁素作為一種腫瘤標志物，能夠在多種癌細胞表面選擇性表達，可以作為脂蛋白、細胞因子等的受體。因此，對核仁素進行靶向和成像，是一種診斷惡性腫瘤的重要手段。Liu等人利用硒納米顆粒，設計了一種新型散射納米探針，將適配體修飾到硒納米顆粒上，能夠精確靶向核仁素高表達的Hep-2細胞，進行暗視野成像（如圖5）。[21]

圖5 應用核仁素適體-硒納米顆粒進行暗場成像Fig.5 Dark field imaging of nucleolin aptamer-selenium nanoparticles[21]

腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一種主要由巨噬細胞產生的能夠抑制或者殺傷腫瘤的細胞因子，能夠造成腫瘤組織的出血性壞死。TNF-α的檢測，對于判斷體內是否有腫瘤有很好的幫助。Ju等人利用3D加強的暗場超分辨顯微鏡和雙編碼等離子納米傳感方法檢測TNF-α。[22]TNF-α可以在單分子水平上進行免疫靶向，而且通過測定陣列芯片上的散射信號進行定量分析。該方法檢測限為65 zM(1.14 ag/mL)，線性范圍為65 zM-2.08 pM(1.14 ag/mL-36.4 pg/mL)。人表皮生長因子受體-2（human growth factor receptor-2，HER2）是一種存在于乳腺癌細胞表面的蛋白質，不但是乳腺癌診斷及臨床治療檢測的重要的標志物，而且是靶向藥物治療乳腺癌的一個重要靶點。Guo等人設計了點擊反應促使修飾有HER2的適體的金納米粒子聚集，并使細胞表面的HER2蛋白原位暗場成像。[23]癌抗原125（CA125）是一種存在于卵巢腫瘤的上皮細胞內的糖蛋白，通常作為卵巢上皮癌的腫瘤標志物。Ju等人利用雙模式暗場顯微鏡檢測CA125。[24]膠體銀標記的CA125在金納米點上進行免疫反應，基于暗場圖像，數字相機和EMCCD分別進行定性和定量分析，發展的免疫傳感器展示了低的檢測限（4 U/mL）和寬的動態監測范圍（4 U/mL-80 U/mL）。

p53蛋白是一種腫瘤抑制蛋白。野生型p53蛋白（WTp53)含有中心特異性DNA結合結構域，能夠綁定一個共識位點的雙鏈DNA。在大多數類型的癌細胞中，p53基因的廣泛變異導致其中心DNA結合域發生變化，失去與DNA的結合能力。突變型p53蛋白(MUp53)的異常表達已被認為是致癌的重要刺激作用。因此，檢測和區分WTp53和MUp53對于癌癥的診斷具有重要意義。Qian等設計了一種雙靶向納米囊泡用于細胞內WTp53和MUp53的原位成像。[25]囊泡包覆的等離子金納米粒子用DNA雙鏈功能化，熒光素標記的MUp53抗體偶聯到納米囊泡的表面。進入細胞以后，釋放的金納米離子通過識別WTp53和雙鏈DNA團聚。可以用暗視野顯微鏡觀察納米探針的顏色變化，定性描述細胞內WTp53蛋白的分布情況，通過熒光素標記的MUp53抗體和MUp53免疫識別，進行MUp53的定位。這樣通過一步孵育的方法實現細胞內WTp53和MUp53的原位成像。

4 暗場光散射技術在胞外囊泡檢測中的應用

胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs)在大部分生物流體中都大量存在，被認為是一類潛在的生物標志物。但是大部分的分析都要求分離和純化步驟，耗費時間和人力。Amrollahi等人發展了一種遠場納米等離子體加強的散射方法對EVs進行免分離表征。[26]EVs首先被癌癥選擇性抗體進行捕獲，然后與偶聯EVs表面CD9蛋白的抗體的金納米棒進行雜交，最后用暗視野顯微鏡進行成像并進行定量。結果顯示（如圖6），用暗場光散射技術檢測上皮細胞黏附因子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）時，可以實現與酶聯免疫測定相同的效果。通過分析血清樣品中的上皮細胞黏附因子的表達，可以實現早期胰腺導管腺癌患者與健康者的區分。腫瘤細胞來源的外泌體(tumor-derived exosome，TEX)是細胞外囊泡其中的一種類型，因其含有蛋白、核酸等多種具有生物學活性的物質，可參與細胞間的通訊及物質交換等過程，促進腫瘤的生長。[27]Wan等人發展了一種快速檢測TEX的方法。[28]TEX首先被外泌體特異性抗體捕獲在載玻片表面，再與納米粒子偶聯的與疾病相關的抗體探針雜交，靶向的外泌體數量應用暗場顯微鏡成像來定量。

圖6 用暗視野顯微鏡測定EpCAM原理圖Fig.6 Schematic diagram of EpCAM detection with DFM[26]

5 結語

本文研究了利用暗場光散射方法檢測DNA、miRNA、蛋白類標志物及細胞外囊泡等腫瘤標志物的研究進展。利用暗場光散射技術檢測腫瘤標志物具有背景值低、靈敏度高等優點，應用范圍廣。但是也存在需要改進的地方，比如等離子共振探針目前限于金、銀、硒等材料，需要探索性能更好的材料；單個顆粒的性質研究不夠完善，需要深入機理研究；大量數據處理限于個人經驗，需要借助于大數據技術，快速準確地提取單顆粒光譜所攜帶的信息；需要發展更加即時快捷的檢測手段，并應用于臨床檢驗中；對細胞內腫瘤標志物進行的定量研究較少，需要克服遇到的困難，建立新的方法，提升檢測水平。暗場光散射技術在腫瘤標志物檢測方面具有巨大的發展潛力。相信隨著儀器技術的進步和檢測方法的提升，未來將會更加廣泛地應用于快速簡單的臨床檢驗，為腫瘤的早期發現、早期治療提供重要的分析手段。