傳統中式火腿加工過程中N-羥乙酰神經氨酸的動態變化

邰勝梅　姚敏　徐阿奇　李仲佰　龔小會　梁美蓮　常瑞　朱秋勁

摘 要：為探究傳統中式火腿加工過程中不同形態N-羥乙酰神經氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）之間的關系，采用高效液相色譜-熒光檢測（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）法測定樣品中總Neu5Gc、游離態Neu5Gc、結合態Neu5Gc的含量。結果表明：上述3 種形態的Neu5Gc含量隨著加工時間的延長均呈前期上升后期降低的趨勢;淺層肌肉半膜肌和深層肌肉股二頭肌中總Neu5Gc和結合態Neu5Gc的含量變化規律相似，因水分含量降低程度的不同而使股二頭肌的變化規律滯后。發酵后期水分損失幅度變緩，股二頭肌中Neu5Gc解離速率高于半膜肌;新鮮豬后腿原料中游離態Neu5Gc含量極少，甚至低于檢測限，結合態Neu5Gc含量與總Neu5Gc含量（15.00～30.62 μg/g）接近。發酵半年、1 年和2 年的火腿中總Neu5Gc含量分別為（15.09±0.39）、（14.52±0.38）、（28.30±0.43）μg/g，均與豬后腿原料中的Neu5Gc含量相近。為進一步探究Neu5Gc的變化，對樣品進行冷凍干燥處理以避免水分含量變化對Neu5Gc含量的影響，結果表明，隨著加工時間的延長，總Neu5Gc、結合態Neu5Gc的含量逐漸降低，且發酵期降低明顯，具有顯著差異性（P<0.05）;游離態Neu5G變化無明顯規律，但與空白樣品相比，其含量呈增加趨勢。

關鍵詞：N-羥乙酰神經氨酸;高效液相色譜-熒光檢測法;傳統中式火腿;解離;加工處理

Dynamic Change of N-Glycolylneuraminic Acid in Chinese Dry-Cured Ham during Processing

TAI Shengmei1，2， YAO Min3， XU Aqi1， LI Zhongbai4， GONG Xiaohui1， LIANG Meilian1， CHANG Rui1，2， ZHU Qiujin1，*

（1. Guizhou Province Key Laboratory of Agricultural and Livestock Products Storage and Processing， School of Liquor and Food Engineering， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 2. School of Food Science and Technology， Jiangnan University，

Wuxi 214122， China; 3. Guizhou Breeding Livestock and Poultry Germplasm Testing Center， Guiyang 550001， China;

4. Panzhou Agricultural Bureau of Guizhou Province， Panzhou 561601， China）

Abstract： The purpose of this study was to explore the relationship between different forms of N-glycolylneuraminic acid （Neu5Gc） during traditional Chinese ham processing. The contents of total Neu5Gc， free Neu5Gc and conjugated Neu5Gc in samples， as determined by high performance liquid chromatography with fluorescence detector （HPLC-FLD）， increased first and decreased later. The contents of total Neu5Gc and conjugated Neu5Gc in Semimembranosus muscle （SM） and Biceps femoris muscle （BF） changed in a similar trend， with BF lagging behind SM due to the different degrees of decrease in water content. In the late stage of fermentation， water was lost slowly， and the dissociation rate of Neu5Gc in BF was higher than that in SM. The content of free Neu5Gc in fresh hind legs was very low， even lower than the detection limit， and the content of conjugated Neu5Gc was close to the content of total Neu5Gc （15.00–30.62 μg/g）. Total Neu5Gc contents in hams fermented for six months， one year and two years were （15.09 ± 0.39）， （14.52 ± 0.38） and （28.30 ± 0.43） μg/g， which were similar to that in fresh hind legs. In order to further explore the change of Neu5Gc， the samples were freeze-dried to avoid the influence of water content change on Neu5Gc content. The contents of total Neu5Gc and conjugated Neu5Gc decreased gradually， especially during the fermentation period， with a significant difference being observed （P < 0.05）. The content of free Neu5G changed irregularly， but showed an increasing trend compared with the blank sample.

Keywords： N-glycolylneuraminic acid; high performance liquid chromatography-fluorescence detection method; Chinese dry-cured ham; dissociation; processing

DOI：10.7506/spkx1002-6630-20210517-138

中圖分類號：TS251.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2021）11-0001-08

引文格式：

邰勝梅， 姚敏， 徐阿奇， 等. 傳統中式火腿加工過程中N-羥乙酰神經氨酸的動態變化[J]. 肉類研究， 2021， 35（11）： 1-8. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210517-138.? ? http：//www.rlyj.net.cn

TAI Shengmei， YAO Min， XU Aqi， et al. Dynamic change of N-glycolylneuraminic acid in Chinese dry-cured ham during processing[J]. Meat Research， 2021， 35（11）： 1-8. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210517-138.? ? http：//www.rlyj.net.cn

傳統中式火腿富含蛋白和許多重要微量元素，滿足人們對紅肉制品口感和營養的需求[1-3]。但研究表明，紅肉內存在一種唾液酸——N-羥乙酰神經氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc），隨著紅肉及其加工肉制品的過多攝入可能會引發癌癥[4-6]，增加患結腸癌、乳腺癌、冠心病等疾病的風險[7-11]。

Neu5Gc是一種酸性氨基糖類[12]，其結構是含11 個碳原子的9碳單糖衍生物，是50多種唾液酸中最常見的3 種核心單體之一[13-14]，主要位于動物細胞膜糖蛋白上和糖脂末端[15]。健康人體自身不能合成Neu5Gc，但可以從外源性食物中獲得Neu5Gc[16]。已有資料證實人體中Neu5Gc的唯一來源是紅肉、奶制品等動物源食品的攝入，尤其是紅肉[17]。膳食Neu5Gc可形成“自身異種抗原”[18]，通過人體組織代謝[16]在體內積累，與人體存在的抗Neu5Gc抗體[19]結合引發持續免疫反應，可能產生或促進慢性炎癥，從而導致癌癥或其他慢性炎癥加劇[9，17，20-22]。莊瀅瀅等[23]研究發現Neu5Gc攝入量與低度慢性炎癥因子C-反應蛋白和白細胞介素6水平呈正相關。Samraj等[17]采用富含Neu5Gc的食物（0.25 mg/g頜下腺黏蛋白）飼喂7 只Neu5Gc缺陷小鼠，短期喂食時其中2 只出現全身炎癥跡象，而長期暴露于這種飲食導致這2 只小鼠出現早期肝細胞癌癥狀，癌癥發病率增加5 倍。紅肉中的Neu5Gc主要以結合態存在，其含量約為游離態Neu5Gc含量的

30 倍[24-25]。飲食中游離態Neu5Gc會迅速隨尿液和糞便排出體外，只有結合態Neu5Gc能在人體腸道、血液和肝臟中穩定存在，引發炎癥反應[17]。為降低食物中總Neu5Gc的含量可能會促使人們減少紅肉攝入量，因此，探析將結合態Neu5Gc轉化為游離態Neu5Gc的行之有效的方法十分必要。

目前可以通過物理法、生物法、酶法等降低食物中Neu5Gc含量，但關于游離態和結合態Neu5Gc之間轉化的深入研究報道不足[26-32]。鄭婉婷等[33]發現新鮮豬肉經腌制處理后3 種不同形態Neu5Gc含量均降低。晏印雪等[27]研究發現發酵肉制品中Neu5Gc含量均低于未發酵肉制品。火腿加工過程中經過失水、發酵和成熟等工藝，使火腿理化性質發生變化，因此，研究加工過程中Neu5Gc的動態變化有利于拓展紅肉制品中Neu5Gc的降解方法和解析其中的變化機理。

本研究采用盤縣火腿制作工藝加工新鮮豬后腿，以新鮮豬后腿和不同加工時間的火腿為實驗材料，采用高效液相色譜-熒光檢測（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）法對傳統中式火腿加工過程中3 種不同形態Neu5Gc的含量進行動態監測，探尋不同加工階段對不同部位肌肉（股二頭肌和半膜肌）制作火腿中結合態和游離態Neu5Gc含量變化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

15 只新鮮豬后腿由貴州省貴陽花溪巨龍屠宰場提供，質量（15.22±0.50）kg，豬品種為長白豬，其年齡、飼養條件相同;半年、1 年和2 年的盤縣火腿購于貴州楊老奶食品有限公司。

Neu5Gc標準品、1，2-二氨基-4，5-亞甲基二氧苯鹽酸鹽（1，2-diamino-4，5-methylenedioxybenzene dihydrochloride，DMB）、β-巰基乙醇（色譜純） 美國

Sigma公司;甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Applichem公司;硫酸銨、冰醋酸、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉（均為分析級） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜儀（配有熒光檢測器和自動進樣器）、ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm） 美國安捷倫科技有限公司;

CTFD-12S冷凍干燥機 青島永合創信電子科技有限公司;

S825-12DT超聲清洗器 上海冠特超聲儀器有限公司;

DY89-II電動玻璃勻漿機 上海安亭科學儀器廠;AR224CN電子分析天平 奧豪斯儀器（貴州）有限公司;H2-16KR臺式高速冷凍離心機 湖南可成儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備和預處理

盤縣火腿加工工藝參考文獻[34]，主要工藝：新鮮豬后腿預冷12 h→鮮腿修割、定形→腌制（分別按腿胚質量的6%、3%和1.5%上鹽腌制3 次，間隔時間分別為2、3、3 d;3 次上鹽后，剩余腌制期階段視腌制情況進行補鹽，補鹽量控制在腿胚質量的1.5%）→上掛晾曬→發酵成熟

新鮮肉樣：分別取0、15、40（腌制期）、60（晾曬期）、80、100、120 d（發酵期）的火腿半膜肌、股二頭肌以及成品火腿，以腌制0 d的肉樣（新鮮肉樣）為對照組。15 只新鮮豬后腿采用上述工藝進行加工，其中7 只每個時間點均取樣，每次取樣部位盡量保持一致，每只火腿取6 個不同點，每只腿取至少100 g，現場切塊包裝，置于-20 ℃冰箱備用。然后再選取5 只火腿（編號為腿Ⅰ、鮮腿Ⅱ、鮮腿Ⅲ、鮮腿Ⅳ、鮮腿Ⅴ）用于比較新鮮豬后腿（0 d）與發酵結束時（120 d）火腿之間3 種形態Neu5Gc的變化，取樣步驟同上。

干基肉樣：分別對0、40（腌制期）、60（晾曬期）、90、120 d（發酵期）的火腿半膜肌、股二頭肌進行取樣。樣品經冷凍干燥處理，置于-80 ℃冰箱備用，用于排除水分含量對加工過程中不同形態Neu5Gc含量變化的影響。其余腿胚備用。

1.3.2 總Neu5Gc含量測定

參考Martin等[35]的方法稍作改進。準確稱取（1.005 5±0.000 5）g樣品，加入10 mL質量分數30%飽和硫酸銨溶液，用勻漿機研磨勻漿，室溫下放置2 h，進行冷凍干燥。冷凍干燥后的粉末加入10 mL 2 mol/L醋酸溶液，于80 ℃水浴3 h，然后12 000 r/min、4 ℃離心15 min，過濾，再次冷凍干燥。冷凍干燥粉末溶于1 mL超純水中，加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，37 ℃水浴30 min，過濾，采用HPLC-FLD法檢測。每組做3 次平行。

1.3.3 游離態Neu5Gc含量測定

參考Ji Suna等[36]的方法稍作改進。準確稱取（1.005 5±0.000 5）g樣品，加入10 mL質量分數30%飽和硫酸銨溶液，勻漿后室溫下放置2 h，以12 000 r/min、4 ℃離心15 min，過濾，收集沉淀進行冷凍干燥。冷凍干燥粉末溶于1 mL超純水中，加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，37 ℃水浴30 min，過濾，采用HPLC-FLD法檢測。每組做3 次平行。

1.3.4 HPLC-FLD法檢測Neu5Gc含量

DMB衍生液的配制及衍生條件：參考Martin等[35]的方法配制含8 mmol/L DMB溶液、1.5 mol/L冰醋酸、0.25 mol/L

硫代硫酸鈉、0.25 mol/L亞硫酸鈉、0.8 mmol/L β-巰基乙醇的衍生液，向標準品中按照體積比9∶1加入DMB衍生液，50 ℃避光衍生2.5 h。衍生結束后，用有機相過濾器過濾，放入HPLC儀中檢測。HPLC檢測條件[35，37]：ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，FLD激發波長373 nm、發射波長448 nm，流動相為乙腈-甲醇-超純水（8∶7∶85，V/V），流速0.9 mL/min，進樣體積10 μL。

配制1 mmol/L Neu5Gc標準品溶液，分別取25、50、100、150、200 μL 1 mmol/L Neu5Gc標準品溶液配制濃度分別為50、100、200、300、400 μmol/L的混合標準液。按照上述步驟進行衍生化和HPLC-FLD法檢測。以Neu5Gc標準品濃度為縱坐標，Neu5Gc標準品峰面積為橫坐標繪制標準曲線，得到標準曲線方程y=0.305 0x+6.769 1（R2=0.999 4）。

總Neu5Gc和游離態Neu5Gc含量采用HPLC-FLD法檢測通過標準曲線方程計算得到。結合態Neu5Gc含量為總Neu5Gc含量與游離態Neu5Gc含量之差。

1.3.5 水分含量測定

采用直接干燥法，稱取5 g絞碎肉樣（精確至0.01 g），用水分測定儀測定水分含量。每個樣品測定2 次，結果取平均值。

1.4 數據處理

實驗結果以平均值±標準差表示;采用Origin 2019b軟件制作繪圖;采用SPSS 17.0軟件中Tukey s-b（K）法進行單因素方差分析，P<0.05表示有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 傳統中式火腿加工過程中新鮮肉樣Neu5Gc的變化

Neu5Gc的保留時間為7.901～8.528 min，由圖1A可知，火腿加工不同時期所測Neu5Gc色譜圖分離效果良好，0 d時總Neu5Gc色譜圖中雜峰很少，隨著時間的延長，雜峰逐漸增多，說明火腿加工過程中物質間不斷轉化，這些雜峰可能是蛋白質水解、脂質氧化等化學反應的產物[38-40]。由圖2B可知，火腿加工過程中所測游離態Neu5Gc色譜圖分離效果良好，但雜峰較多，說明未酸解的樣品所得色譜圖雜峰較多，且游離態Neu5Gc含量很低，可見樣品預處理中酸解后不僅可以檢測總Neu5Gc含量，且減少了其他物質干擾，保證Neu5Gc色譜圖的分離效果。

2.2 傳統中式火腿加工過程中干基肉樣Neu5Gc的變化

水分含量是影響火腿加工過程中Neu5Gc含量的重要因素。由圖2A可知，隨著加工時間的延長，至120 d時火腿股二頭肌和半膜肌的水分含量由最初的74.13%分別降低至53.56%和46.61%。為了排除水分含量變化對Neu5Gc含量的影響，樣品經冷凍干燥處理后按照新鮮樣品的檢測方法測定火腿干基肉樣中的Neu5Gc含量。由圖2B～D可知，隨著加工時間的延長，半膜肌和股二頭肌中總Neu5Gc和結合態Neu5Gc含量均逐漸降低（P<0.05），而游離態Neu5Gc含量先增加后減少（P<0.05）。腌制期間（0～40 d）水分和鹽分發生遷移，此階段股二頭肌和半膜肌中結合態Neu5Gc含量均降低，游離態Neu5Gc急劇增加，但總Neu5Gc含量變化不顯著;晾曬期間（40～60 d）溫度升高使肉樣組織中酶活性和化學反應效率提高，游離態Neu5Gc的降解速率大于結合態Neu5Gc的解離速率，導致3 種形態Neu5Gc的含量均降低;發酵期（60～120 d）糖蛋白和脂質末端的結合態Neu5Gc繼續解離成為游離態Neu5Gc[41-42]，但其解離速率低于游離態Neu5Gc的降解速率，導致總Neu5Gc和結合態Neu5Gc含量繼續降低，游離態Neu5Gc含量較穩定。晾曬期結束時，半膜肌中3 種形態Neu5Gc的含量均低于股二頭肌;進入發酵期后，隨著發酵時間的延長，股二頭肌中3 種形態Neu5Gc的含量整體低于半膜肌。不同加工階段干基肉樣中3 種形態Neu5Gc含量變化趨勢揭示，傳統中式火腿加工過程中總Neu5Gc和結合態Neu5Gc含量逐步降低。晏印雪等[27]研究發現不同發酵紅肉制品中Neu5Gc含量存在顯著差異（P<0.05），且均低于未發酵紅肉制品中的Neu5Gc含量，揭示了發酵對Neu5Gc降解的影響。

2.3 傳統中式火腿典型加工工藝對3 種形態Neu5Gc轉變的影響

由表1可知，隨著加工時間的延長，火腿樣品中總Neu5Gc和結合態Neu5Gc含量均呈先升高后降低的趨勢，這是由于腌制期與晾曬期火腿中水分含量大幅度減少（圖2A），導致在單位質量下干物質含量增加，而Neu5Gc主要以結合態存在于糖蛋白和糖脂的糖基化末端[41-42]，因此導致總Neu5Gc和結合態Neu5Gc含量的增加。發酵期間（60～120 d），火腿半膜肌中總Neu5Gc和結合態Neu5Gc含量降低，120 d時總Neu5Gc和結合態Neu5Gc含量與鮮腿（0 d）時具有顯著差異（P<0.05），股二頭肌中總Neu5Gc和結合態Neu5Gc含量變化規律與半膜肌相似。Neu5Gc含量的升高主要與水分流失有關。在腌制期（0～40 d），火腿股二頭肌總Neu5Gc的增加量低于半膜肌，可能是因為股二頭肌失水速率低于半膜肌的原因所致。晾曬期（40～60 d），火腿股二頭肌總Neu5Gc繼續增加，而半膜肌總Neu5Gc開始降低，表明股二頭肌中Neu5Gc的變化慢于半膜肌。發酵期（60～120 d），股二頭肌總Neu5Gc和結合態Neu5Gc的減少量均高于半膜肌，說明發酵期股二頭肌結合態Neu5Gc的解離速度較半膜肌快，具體原因有待深入研究。

鮮腿（0 d）的游離態Neu5Gc含量很低。Ji Suna等[36]等的研究結果表明，游離態Neu5Gc含量在3、38 日齡和成年豬肌肉中的變化不具有規律性，但總Neu5Gc、結合態Neu5Gc含量是游離態Neu5Gc的數十倍。由表1可知，隨著加工時間的延長，游離態Neu5Gc含量先增加后降低。游離態Neu5Gc含量增加，一是由于水分流失，干物質含量相對增加;二是火腿加工過程中結合態Neu5Gc與糖蛋白和脂質末端解離。發酵期結合態Neu5Gc解離速率低于游離態Neu5Gc的降解速率，從而導致游離態Neu5Gc含量的降低。發酵期游離態Neu5Gc顯著高于鮮腿（P<0.05）。

2.4 不同成熟期傳統中式火腿中Neu5Gc含量的變化

由表2可知，新鮮豬后腿中總Neu5Gc含量為15.00～30.62 μg/g，與報道中結果[33，43-44]一致。經120 d加工（發酵60 d）后，其中總Neu5Gc和結合態Neu5Gc含量均降低，游離態Neu5Gc含量增加。

上述傳統中式火腿因發酵期短，僅60 d，仍屬新制火腿。為進一步了解長時間發酵的傳統中式火腿中Neu5Gc變化，選擇發酵半年、1 年和2 年的成品火腿檢測其中3 種形態Neu5Gc含量。由表3可知，發酵半年、1 年和2 年成品火腿中總Neu5Gc含量分別為15.09、14.52、28.30 μg/g，游離態Neu5Gc含量分別為2.69、6.18、7.46 μg/g，結合態Neu5Gc含量分別為14.51、10.46、22.95 μg/g。與新制火腿加工過程（0～120 d）中Neu5Gc的變化不同，長時間發酵成品火腿中游離態Neu5Gc含量明顯增多，與文琦[43]的研究結果一致。

年齡、飼養條件等不同均會使火腿中Neu5Gc含量不同[45]，導致差異的原因有待研究。無論發酵期長短，新鮮豬后腿和成品火腿間的總Neu5Gc含量相近，與新鮮豬后腿相比，成品火腿中水分含量降低，但未導致總Neu5Gc含量顯著升高，間接證明傳統中式火腿的加工過程具有降低Neu5Gc含量的作用，其降解機制還需深入研討。

3 結 論

本實驗對傳統中式火腿加工過程中以及企業成品火腿中Neu5Gc含量進行檢測。隨著加工時間的延長，總Neu5Gc、結合態Neu5G、游離態Neu5Gc的含量均呈先升高后降低的趨勢;新鮮豬后腿中幾乎不含或含有極少量的游離態Neu5Gc，但加工過程中火腿游離態Neu5Gc含量有所增加;發酵半年、1 年和2 年的成品火腿中也發現了游離態Neu5Gc，明顯高于新鮮豬后腿中游離態Neu5Gc;在不同加工時期，干基肉樣中總Neu5Gc、結合態Neu5Gc含量逐漸降低，且發酵期降低幅度較大，差異性顯著（P<0.05），游離態Neu5Gc含量先升高后降低。

綜上，無論是在實驗室腌制火腿還是成品火腿中，均發現火腿加工工藝有利于結合態Neu5Gc從糖蛋白和脂蛋白末端的解離，從而轉化為游離態Neu5Gc，游離態Neu5Gc進一步的降解導致了總Neu5Gc的降低。目前，尚未有關于發酵過程中化學、微生物變化對火腿中不同形態Neu5Gc轉化影響的研究，進一步研究應闡釋發酵期間這些變化對Neu5Gc降解的影響。

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收稿日期：2021-05-17

基金項目：貴州省科技計劃項目（黔科合支撐[2019]2374號）;貴州省高層次創新型人才培養項目（黔科合平臺人才[2017]5788）;

貴州省生態特色肉制品科技創新人才團隊（黔科合平臺人才[2020]5004）

第一作者簡介：邰勝梅（1996—）（ORCID： 0000-0002-1967-246X），女，碩士研究生，研究方向為食品安全檢測與控制。

E-mail： 847763581@qq.com

*通信作者簡介：朱秋勁（1969—）（ORCID： 0000-0002-0392-4992），男，教授，博士，研究方向為食品營養與安全和畜產品加工。E-mail：ls.qjzhu@gzu.edu.cn