短梗菝葜乙酸乙酯部位抗腫瘤活性譜效關系

陳藝粼，晁利芹，蘇秀紅,3*，董誠明,3，蘭金旭,3，陳隨清,3

(1.河南中醫(yī)藥大學藥學院，河南 鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院，河南 鄭州 450046；3.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046)

短梗菝葜(SmilaxscobinicaulisC.H.Wright)，又名黑刺菝葜，其根及根莖入藥，在我國北方作為鐵絲靈仙藥用也已有多年歷史，具有祛風除濕、活血通絡、解毒散結(jié)等功效，臨床用于治療風濕痹痛，關節(jié)不利、瘡癤、腫毒、瘰疬、癌癥等功效[1-3]。從短梗菝葜正丁醇部位中提取分離出少數(shù)甾體皂苷類單體成分具有體外抗腫瘤活性[2]，但關于短梗菝葜更多抗腫瘤活性成分的篩選研究較少，且未闡明其作用的物質(zhì)基礎。

中藥材種類多，成分復雜，其功效是多種化學成分共同作用的結(jié)果，中藥指紋圖譜是對中藥整體的化學成分組成的質(zhì)量控制，與中藥的功效沒有直接的內(nèi)在聯(lián)系，而建立中藥指紋圖譜譜效關系，將指紋圖譜中化學成分的變化與藥效結(jié)合，可更好的對中藥的質(zhì)量控制和藥效評價[4]。

對短梗菝葜不同提取部位，采用MTT法，考察各部位對人肝癌SMMC-7721細胞、人非小細胞肺癌A549細胞、人胃癌MGC80-3細胞存活率影響，并確定其抗腫瘤活性部位；建立活性部位指紋圖譜，通過指紋圖譜特征與藥效的之間的相關性，并運用偏最小二乘法，構建譜效關系，初步確定具體發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎，為短梗菝葜質(zhì)量控制和臨床應用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 短梗菝葜產(chǎn)地見表1，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學蘇秀紅教授鑒定為百合科菝葜屬短梗菝葜SmilaxscobinicaulisC.H.Wright的根及根莖。

表1 短梗菝葜產(chǎn)地

1.2 細胞 人肝癌SMMC-7721細胞、人非小細胞肺癌A549細胞、人胃癌MGC80-3細胞，由河南中醫(yī)藥大學藥理實驗室饋贈。

1.3 儀器 e2695-2489型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；MS105DU電子分析天平(萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；VARIOSKAN LUX型自動酶標儀(美國賽默飛世爾公司)；AE2000倒置顯微鏡(德國Motic公司)；371型CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scilentific公司)；EYELAN-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、FDU-1200型冷凍干燥機(上海愛朗儀器有限公司)。

1.4 試劑 胎牛血清(批號SA190501)、MEM培養(yǎng)基(批號WH0111201911SP)(武漢普諾賽生命科技有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(批號20191129)、噻唑藍(MTT，批號725C0511)、DMSO(批號11001G031)、0.25%胰酶(批號20150302)、青霉素-鏈霉素混合液(雙抗)(批號20190712)(北京索萊寶科技有限公司)。白藜蘆醇(純度≥98%)。乙腈為色譜純；水為超純水；其余試劑為分析純。

2 方法

2.1 抗腫瘤活性部位篩選

2.1.1 樣品制備 稱取藥材粉末(S1，過四號篩)100 g，加入70%乙醇，在料液比1∶10條件下回流提取3次，每次1.5 h，冷卻，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，得到乙醇總提物，蒸干后加200 mL熱水，取1/5作為乙醇總提取液，剩余4/5依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取至近無色為止，減壓回收各部位萃取液，浸膏加適量水成混懸液，置于超低溫冰箱中保存3 d，放置冷凍干燥機中1 d，得到乙醇總提物(得率0.519%)、石油醚部位(得率0.159%)、乙酸乙酯部位(得率1.27%)、正丁醇部位(得率2.812%)、剩余液(得率1.672%)，加入DMSO至0.1 g/mL，臨用前用培養(yǎng)基稀釋成不同質(zhì)量濃度的供試液，所含DMSO的體積分數(shù)不超過千分之一。

2.1.2 細胞培養(yǎng) 在5%CO2、37 ℃下，用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)SMMC-7721細胞，含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)A549、MGC80-3細胞。

2.1.3 MTT法 參考文獻[5-8]報道，將處于對數(shù)生長期的SMMC-7721、A549、MGC80-3細胞用0.25%胰酶消化成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5×104個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸棄原培養(yǎng)液，加入含不同質(zhì)量濃度藥物的培養(yǎng)基，每種藥物設5個，分別為12.5、25、50、75、100 μg/mL，每孔100 μL，每個質(zhì)量濃度設3個復孔，同時設立對照組，只加入等體積的無血清培養(yǎng)基。于給藥48 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，混勻后置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸棄各孔中上清液，加入150 μL DMSO，振蕩混勻15 min，待其各孔中的紫色結(jié)晶完全溶解后置于自動酶標儀中，測定各孔光密度(OD值，波長490 nm)，重復3次，計算細胞存活率，細胞存活率=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

2.2 HPLC指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件 ZORBAX SB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～15 min，5%～10%A；15～35 min，10%～15%A；35～55 min，15%～20%A；55～90 min，20%～30%A；90～105 min，30%～33%A)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長330 nm；進樣量10 μL。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取白藜蘆醇適量，加甲醇溶解，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 按“2.1.1”項下方法制備乙酸乙酯部位，稱取10 mg，定容至2 mL量瓶中，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 精密度試驗 精密吸取同一份供試品溶液(S1)，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6次，以10號峰白藜蘆醇為參照，測得22個共有峰相對保留時間RSD均小于2%，相對峰面積RSD均小于5%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 重復性試驗 精密稱取同一批藥材粉末6份(S1)，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，以10號峰白藜蘆醇為參照，測得22個共有峰相對保留時間RSD均小于2%，相對峰面積RSD均小于5%，表明該方法重復性良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液(S1)，于0、4、8、12、16、24 h在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，以10號峰白藜蘆醇為參照，測得22個共有峰相對保留時間RSD均小于2%，相對峰面積RSD均小于5%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 乙酸乙酯部位對MGC80-3細胞存活率的影響 按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，得到乙酸乙酯部位(100 μg/mL)，采用MTT法測定它對人胃癌MGC80-3細胞的存活率。

2.4 譜效關系研究 采用偏最小二乘法進行相關性分析，以指紋圖譜中各共有峰的峰面積為自變量X，MGC80-3腫瘤細胞存活率為因變量Y，通過SIMCA-P 13.0軟件對其進行偏最小二乘回歸分析，建立回歸方程。

3 結(jié)果

3.1 不同提取部位對細胞存活率的影響

3.1.1 SMMC-7721細胞 石油醚、乙酸乙酯部位對SMMC-7721細胞存活率均具有不同程度的抑制作用，與對照品比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2，IC50值分別為84.47、47.71 μg/mL，見表3。其中，乙酸乙酯部位抑制作用最強，乙醇提取物和剩余物均無抑制作用，正丁醇部位反而可促進其增殖，見圖1。

3.1.2 A549細胞 不同提取部位對A549細胞的存活率與對照品比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。乙酸乙酯部位具有明顯的抑制作用，IC50值為71.98 μg/mL，最大抑制濃度為100 μg/mL，細胞存活率為40.05%，呈量效關系；乙醇提取物、正丁醇部位、剩余物均無抑制作用或促進其增殖，見圖1。

3.1.3 MGC80-3細胞 不同提取部位對MGC80-3細胞存活率均具有不同程度的抑制作用，與對照品比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。細胞存活率均在80%以下，乙酸乙酯部位具有明顯的抑制作用，并呈劑量依賴性，IC50為27.87 μg/mL，見表3。乙醇提取物、石油醚部位、正丁醇部位和剩余液對該細胞的抑制作用及變化不明顯，均未達到50%，見圖1。

圖1 不同提取部位對細胞存活率的影響

表2 不同提取部位對細胞存活率的影響

表3 不同提取部位對細胞的IC50值

3.1.4 小結(jié) 乙酸乙酯部位對MGC80-3細胞較敏感，抑制作用較強，最大抑制濃度為100 μg/mL，故選擇其進行后續(xù)實驗。

3.2 圖譜生成 按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液制備10批樣品的供試品溶液，各取10 μL，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，將相關數(shù)據(jù)導入中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2012.130723版本)，設置S1圖譜為參照，采用中位數(shù)法，時間窗寬度為0.1，得到指紋圖譜(圖2)，確定22個共有峰，以10號峰白藜蘆醇為參照，發(fā)現(xiàn)各共有峰相對保留時間一致，但相對峰面積RSD、峰面積值差異較大，表明不同產(chǎn)地藥材主要成分含量具有一定差異，見表4～5。除S3、S5外，其他8批藥材相似度均在0.9以上，見表6。

圖2 10批樣品HPLC指紋圖譜

表4 乙酸乙酯部位共有峰相對保留時間

表5 乙酸乙酯部位共有峰相對峰面積

表6 10批樣品相似度

3.3 對MGC80-3細胞存活率的影響 10批樣品乙酸乙酯部位均有較好抑制腫瘤的作用，與對照品比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，以S1最強，見表7。

表7 10批樣品乙酸乙酯部位對MGC80-3細胞存活率的影響

3.4 譜效關系研究

3.4.1 偏最小二乘回歸方程 通過SIMCA-P 13.0軟件進行偏最小二乘回歸分析[9-11]，得方程為Y=0.177 3X1+0.295 8X2+0.035 2X3-0.217 4X4-0.173 7X5+0.016 0X6+0.465 4X7+0.342 8X8-0.016 4X9+0.034 1X10+0.150 5X11+0.178 7X12-0.352 2X13+0.097 8X16-0.148 7X17-0.060 5X18-0.300 1X19-0.036 4X20-0.421 2X21-0.123 9X22，回歸系數(shù)見圖3。由此可知，峰1、2、3、6、7、8、10、11、12、14、15、16、20與藥效呈正相關，貢獻度依次為為7>8>15>2>12>1>11>16>20>3>10>6；峰4、5、9、13、17、18、19、21、22與藥效呈負相關，貢獻度依次為21>13>19>4>5>17>22>18>9>14。

圖3 各共有峰偏最小二乘回歸系數(shù)

3.4.2變量重要性 變量投影重要性(VIP值)分析結(jié)果見圖4，可知X1、X2、X4、X7、X13、X17、X18、X19、X21的VIP值大于1，依次為X21>X7>X1>X19>X18>X4>X2、X17>X13，其中X1、X2、X7與藥效呈正相關，VIP值也較大，而X4、X13、X17、X18、X19、X21與藥效呈負相關；R2X=0.918，R2X=1，Q2=0.734，表明該模型擬合解釋、模型預測能力較強。

圖4 各共有峰的變量重要性

4 討論

本實驗以SMMC-7721、A549、MGC80-3細胞為篩選模型，以抗腫瘤活性為指標，對短梗菝葜不同提取部位進行抗腫瘤活性篩選，結(jié)果抗腫瘤活性物質(zhì)主要存在于乙酸乙酯部位，對3種腫瘤細胞均具有抑制作用，但不同腫瘤細胞株對同一藥物的敏感性不同，最佳細胞敏感株為MGC80-3細胞。張蓮萍等[12]從同屬植物“菝葜”中提取分離出的白藜蘆醇、β-谷甾醇、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷等化學成分，具有較好的抗腫瘤活性；而張存莉等[13]發(fā)現(xiàn)短梗菝葜乙酸乙酯部位中也具有上述化學成分；本研究也發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位具有較強的抗腫瘤活性，可能與該部位中的這些成分有關。正丁醇部位卻具有促進腫瘤細胞增殖的作用，而許靜等[2]從正丁醇部位分離出的僅有少數(shù)甾體皂苷類單體成分具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，大部分則無抑制腫瘤作用；可能與本實驗提取的正丁醇部位為粗提物有關，粗提物中含有多種化學成分，化學成分之間相互拮抗或協(xié)同作用，而影響抗腫瘤活性；乙醇總提物和剩余液幾乎無抑制腫瘤細胞增殖的作用。本實驗初步確定了短梗菝葜乙酸乙酯部位為主要的抗腫瘤活性部位，但抗腫瘤的活性成分有待進一步的分離純化，并更深入的研究其抗腫瘤的作用機制。

在倒置顯微鏡下觀察各提取部位給藥后SMMC-7721、A549和MGC80-3細胞形態(tài)及細胞數(shù)目的變化，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位給藥前細胞貼壁性好，細胞伸展開，飽滿，增殖旺盛，經(jīng)不同濃度給藥48 h后，細胞形態(tài)變?yōu)閳A形，甚至破碎，皺縮，細胞間隙增大，引起腫瘤細胞發(fā)生凋亡或壞死，同時發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的不斷增大，細胞凋亡率也逐漸增大；正丁醇部位細胞形態(tài)無明顯變化，但隨著藥物濃度的增大，細胞數(shù)量明顯增加，因而促進了腫瘤細胞的增殖，但采用乙醇總提物、乙醚部位及剩余液給藥后細胞形態(tài)及數(shù)目則無明顯的變化。

在指紋圖譜相似度評價中，濟源市思禮鎮(zhèn)九里溝鄭坪村郭莊(S3)和安陽市林州石板巖鎮(zhèn)紅土崗(S5)產(chǎn)地的相似度分別為0.864和0.75，相似度較低原因是可能與化學成分含量的差異相關；而引起化學成分的差異又與氣候和地理因素等相關。賀建武等[14]研究發(fā)現(xiàn)，相對濕度、年降水量和年最低溫等是影響菝葜主要藥效成分的主導因子，年最低溫、年均溫和≥10 ℃有效積溫與菝葜藥效成分呈正相關,相對濕度、年降水量和無霜期與菝葜藥效成分呈負相關。如濟源市思禮鎮(zhèn)九里溝郭莊(S3)的峰面積與其他產(chǎn)地比較，X1、X3、X7、X8、X9、X10的峰面積較小，可能與相對濕度、年降水量和無霜期有關，而導致含量較低；安陽市林州石板巖鎮(zhèn)紅土崗(S5)的峰面積與其他產(chǎn)地比較，X2、X4、X5、X6、X8、X9、X10、X11、X13、X15、X16的峰面積較大，可能與年最低溫、年均溫和≥10 ℃有效積溫等有關，而導致含量較高。

偏最小二乘回歸法是集多因變量對多自變量的回歸建模以及多元線性回歸分析、主成分分析、典型相關分析功能為一體的多元數(shù)據(jù)分析方法，能消除自變量之間的多重相關性，辨識系統(tǒng)中的信息與噪聲，更好的體現(xiàn)中藥成分與藥效之間的相關性，是構建中藥譜效關系的一種有效方法。本實驗采用偏最小二乘法建立短梗菝葜乙酸乙酯部位譜效方程，結(jié)果顯示各成分均對MGC80-3細胞存活率有影響，其中9個成分對藥效的影響較大，分別X1、X2、X4、X7、X13、X17、X18、X19、X21，說明其抗腫瘤作用取決于多種化學物質(zhì)共同作用的結(jié)果；X21在指紋圖譜中含量較低，且在偏最小二乘中與藥效呈負相關，是發(fā)揮主要作用的藥效物質(zhì)，而X10為白藜蘆醇，含量較高，與藥效呈正相關，卻不是發(fā)揮藥效的關鍵物質(zhì)，可見中藥化學成分的復雜性。由于有關短梗菝葜化學成分文獻報道較少，故無法指認與其對應的化合物，后續(xù)研究中有待分離純化活性成分并進行鑒定。