葛根芩連湯對濕熱型潰瘍性結腸炎大鼠結腸病理損傷及Th17/Treg的影響

黃文娟，盧學嘉，房其軍，朱欣佚*

(1.東南大學附屬中大醫院健康管理中心，江蘇 南京 210000；2.東南大學附屬中大醫院消化科，江蘇 南京 210000；3.南京鼓樓醫院中醫科，江蘇 南京 210000)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是臨床常見的慢性非特異性胃腸道疾病，以腹痛、血便等為主要臨床表現，遷延難愈，且可能發展為結腸癌。近年來研究發現，輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17)和調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)調控關系的失衡是潰瘍性結腸炎發病的主要因素[1]。Th17、Treg細胞在分化中相互抑制且在功能上負性調節，兩者動態平衡在維持免疫穩定中發揮關鍵作用[2-3]。因此，調節Th17/Treg平衡，恢復機體免疫穩態，可能是治療潰瘍性結腸炎的新途徑。

葛根芩連湯，始載于《傷寒論 太陽病脈證并治》，以清熱、堅陰、止痢為主，兼有透表、解表清里之功，已在潰瘍性結腸炎治療中獲取滿意效果[4-5]。但關于其對濕熱型潰瘍性結腸炎結腸病理損傷及Th17/Treg影響的研究尚少。本研究采用濕熱型潰瘍性結腸炎大鼠模型，研究葛根芩連湯對其結腸病理損傷及Th17/Treg的影響，為治療該病提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠70只，雌雄各半，6周齡，體質量180～200 g，購自上海南方模式生物科技股份有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(滬)2017-0010，適應性喂養3 d。

1.2 試劑與藥物 葛根芩連湯由東南大學附屬中大醫院提供，按照葛根、黃連、黃芩、甘草=8∶3∶3∶2比例浸泡30 min，加入8倍量水煎煮40 min，3 500 r/min離心20 min，濃縮成生藥量20 g/10 mL的濃縮液，使用前用生理鹽水稀釋至相應質量濃度，4 ℃冷藏保存。柳氮磺胺吡啶片(生產批號02000052，國藥準字H31020557，上海信誼嘉華藥業有限公司)。2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)溶液(南京信帆生物技術有限公司)；CD4抗體、白介素-17(IL-17)抗體、Foxp3抗體(上海古朵生物科技有限公司)；兔抗大鼠維甲酸相關孤兒受體γt(retinoid-related orphan receptor gamma-t，RORγt)、叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子(forkhead/winged helix transcription factor，Foxp3)一抗(英國Abcam公司)。

1.3 儀器 FACSCanto Ⅱ流式細胞儀(美國BD公司)；H7500電子顯微鏡(日本株式會社日立制作所)；iBright Imager凝膠成像分析系統(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

2 方法

2.1 模型建立 采用高糖、高脂飲食飼養大鼠，即在普通飼養的基礎上增加蜂蜜水200 g/L自由飲用，隔天灌胃給予10 g/kg油脂，隔天灌胃給予10 mL/kg白酒，共10 d，飼養于相對濕度95%、溫度(32±2)℃的氣候箱中，共計5 d。將大鼠從氣候箱中移出，禁食不禁水24 h，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，固定于手術臺上，從肛門輕插入一根橡膠輸液管(長12 cm，直徑2.0 mm)深約8 cm，100 mg/kg TNBS溶于500 mL乙醇中，一次性推入結腸0.25 mL，提大鼠尾部使其倒立30 s，保持平躺，觀察一般情況。模型建立10 d后，根據大鼠一般情況判斷建模是否成功[6]。

2.2 分組及給藥 從70只大鼠中隨機抽取10只飼喂普通飼料，其余60只建立濕熱型潰瘍性結腸炎模型，將建模成功的50只隨機分為模型組，葛根芩連湯低、中、高劑量組，柳氮磺胺吡啶組，每組10只。建模后10 d，葛根芩連湯低、中、高劑量組開始以5、10、20 g/kg生藥量灌胃給予濃縮液；柳氮磺胺吡啶組將藥物搗碎、研磨后，與生理鹽水混合，以0.3 g/kg劑量灌胃給藥。各組給藥容積均為10 mL/kg，連續干預2周；正常組、模型組灌胃給予等容量生理鹽水灌胃。觀察大鼠一般情況，采用疾病活動指數(disease activity index，DAI)評分評價，包括①體質量分為不變(0分)、較正常降低1～5%(1分)、6～10%(2分)、11～15%(3分)、>15%(4分)；②大便泄瀉程度分為正常(0分)、松散(2分)、腹瀉(4分)；③便血分為正常(0分)、肉眼血便(2分)。

2.3 外周血單個核細胞(PBMC)分離 末次給藥后，大鼠禁食24 h不禁水，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，采集腹主動脈血5 mL，置于肝素抗凝管中，與PBS緩沖液等比例稀釋，梯度離心后分離淋巴細胞，PBS緩沖液洗滌，調整細胞密度至1×107/mL。

2.4 外周血Th17細胞比例檢測 取96孔板，每孔中加入PBMC懸液100 μL，設置同型對照，加入刺激劑0.5 μL(調零孔除外)，置于培養箱中培養60 min，以0.5 μL阻斷劑阻斷，在標準條件(5% CO2、37 ℃、飽和濕度)下孵育12 h，將細胞懸液轉移至流式管中，加入0.5 μL CD4抗體，常溫下遮光孵育20 min，PBS緩沖液洗滌，離心后棄去上清，加入100 μL PBS重懸，再加入固定破膜工作液，振蕩5 s混合均勻，4 ℃遮光孵育40 min，加入破膜緩沖工作液2 mL，離心后洗滌細胞，棄去上清，余下液體中加入PBS緩沖液至100 μL，重懸，在檢測管中加入IL-17抗體0.7 μL，將等量、同型對照抗體加入對照管中，4 ℃遮光孵育40 min，洗滌后棄上清，加入4%多聚甲醛重懸，4 ℃遮光保存，24 h內使用流式細胞儀檢測。

2.5 外周血Treg細胞比例檢測 取PBMC懸液100 μL轉移至流式管中，加入CD4抗體0.5 μL，常溫遮光孵育20 min，PBS洗滌后棄去上清，余下液體中加入PBS緩沖液至100 μL，重懸，在檢測管中加入Foxp3抗體5 μL，將等量、同型對照抗體加入對照管中，4 ℃遮光孵育40 min，洗滌后棄上清，加入4%多聚甲醛重懸，4 ℃遮光保存，24 h內使用流式細胞儀檢測。

2.6 結腸組織病理變化觀察 腹主動脈血取血后處死大鼠，打開腹腔，分離結腸病變區組織，分為2份，1份用4%多聚甲醛固定后梯度脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，制作成5 μm切片；另1份保存于液氮中，用于蛋白檢測。取大鼠結腸組織切片常規脫蠟，沖洗1 min，加入蘇木素染色液染色5 min后沖洗2 min，滴入1%鹽酸酒精，沖洗2 s，促藍液反藍，沖洗15 s，1%伊紅液染色30 s，自來水略洗后依次使用85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇脫水，每次30 s，二甲苯透明2次，每次3 s，中性樹膠封固，顯微鏡下拍照觀察。

2.7 結腸組織IFN-γ表達檢測 取大鼠結腸組織切片，脫蠟后PBS沖洗，3%過氧化氫孵育15 min，PBS浸泡30 min，滴加枸櫞酸鹽抗原修復液，微波后冷卻至40 ℃，蒸餾水沖洗，滴加山羊血清室溫下封閉15 min，棄血清，滴加兔抗大鼠IFN-γ一抗(1∶800)，濕盒中4 ℃過夜，PBS沖洗，滴加山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，37 ℃孵育15 min，PBS沖洗，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，常規脫水，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察，隨機選取5個不相鄰視野，計算IOD值。

2.8 結腸組織RORγt、Foxp3蛋白表達檢測 采用Western blot法。取冷凍保存的大鼠結腸組織，充分研磨后加入裂解液提取總蛋白，BCA法定量蛋白濃度，取30 μg上樣，10% SDS-PAGE電泳后濕轉至膜，室溫下封閉液封閉2 h，加入兔抗大鼠RORγt、Foxp3一抗(1∶500)，4 ℃搖床孵育過夜，洗滌，滴加山羊抗兔二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，暗室中曝光、顯影、定影，凝膠成像系統掃描，計算目的蛋白/內參GAPDH條帶灰度值比值。

3 結果

3.1 大鼠一般情況 高糖、高脂飼養，灌服白酒加TNBS推入結腸后，可導致大鼠食欲不振、體質量減輕、喜臥懶動、精神萎靡，便稀或黏液樣血便、便次增加，類似脾胃濕熱的表現，表明建模成功。與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組、葛根芩連湯各劑量組大鼠上述表現明顯改善。與正常組比較，模型組大鼠DAI評分升高(P<0.01)；與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組、葛根芩連湯各劑量組大鼠DAI評分均降低(P<0.05，P<0.01)，并呈量效關系，見表1。

表1 葛根芩連湯對大鼠DAI評分的影響

3.2 結腸病理變化 正常組大鼠結腸黏膜光滑、完整，腺體層次清晰，未觀察到中性粒細胞浸潤、潰瘍、糜爛等；模型組大鼠結腸組織明顯水腫、充血，腸壁凹陷，黏膜上皮細胞損傷破裂、排列紊亂，細胞核模糊、縮聚，可觀察到細胞脫落及腸絨毛損傷、大量炎性細胞浸潤；柳氮磺胺吡啶組、葛根芩連湯各劑量組大鼠上述病理變化有所減輕，見圖1。

圖1 各組大鼠結腸組織病理變化(HE，×100)

3.3 葛根芩連湯對大鼠結腸組織IFN-γ表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠IFN-γ表達升高(P<0.01)；與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組、葛根芩連湯各劑量組大鼠IFN-γ表達降低(P<0.05，P<0.01)，并呈量效關系，見表2、圖2。

圖2 各組大鼠結腸組織IFN-γ表達(HE，×400)

表2 葛根芩連湯對大鼠結腸組織IFN-γ表達的影響

3.4 葛根芩連湯對大鼠外周血Th17/Treg平衡的影響 與正常組比較，模型組大鼠外周血Th17、Th17/Treg升高(P<0.01)，Treg比例降低(P<0.01)；與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組、葛根芩連湯各劑量組大鼠外周血Th17、Th17/Treg降低(P<0.05，P<0.01)，Treg比例升高(P<0.01)，并呈量效關系，見表3。

表3 葛根芩連湯對大鼠外周血Th17/Treg平衡的影響

3.5 葛根芩連湯對大鼠結腸組織RORγt、Foxp3蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠結腸組織RORγt蛋白表達升高(P<0.01)，Foxp3蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組、葛根芩連湯各劑量組大鼠結腸組織RORγt蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)，Foxp3蛋白表達升高(P<0.01)，并呈量效關系，見表4、圖3。

表4 葛根芩連湯對大鼠結腸組織RORγt、Foxp3蛋白表達的影響

圖3 各組大鼠結腸組織RORγt、Foxp3蛋白表達

4 討論

潰瘍性結腸炎是在遺傳易感性、環境因素、腸道微生物等作用下，腸道免疫功能異常導致的一種發病于直腸與結腸的炎性病變[7]。中醫認為，潰瘍性結腸炎屬于“臟毒”“腸澼”“便血”等范疇，以本虛標實、虛實夾雜為病機，可生成痰、瘀、濕、熱、毒，導致病程遷延難愈[8]。濕熱型潰瘍性結腸炎病位在大腸，因邪盛正虛、飲食不潔、情志不調而發病，多為濕熱蘊滯大腸，致脾腎虧虛，故以清熱燥濕、養血生肌、補脾益腸、涼血止痢為治療原則[9-10]。

Th17細胞主要通過釋放炎性因子IL-17加劇炎性反應，而Treg細胞可抑制抗原呈遞細胞及T細胞功能，減少炎性細胞因子及抗體產生，對于維持自身免疫耐受及免疫內環境平衡起到關鍵性作用[11]。IFN-γ是一種由活化的中性粒細胞與T細胞分泌的細胞因子，其可通過調節免疫細胞平衡參與細胞免疫，并通過招募炎性細胞導致腸成纖維細胞生成大量基質降解酶，破壞黏膜完整性，引發潰瘍。本研究結果顯示，葛根芩連湯各劑量組可改善大腸結腸病理變化，且可降低外周血中Th17細胞比例，提高Treg比例，維持Th17/Treg平衡，減少結腸組織中IFN-γ表達，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，表明葛根芩連湯可調節Th17/Treg平衡，減輕結腸病理變化與黏膜損傷。葛根芩連湯是經典古方之一，由醫圣張仲景創立，方中以葛根為主藥，味辛、涼、甘，透表解肌，升脾胃清陽之氣，治下痢；黃芩性苦寒，可清肺胃膽、上焦、大腸濕熱；黃連性大苦、大寒，瀉火解毒、清中焦濕熱；甘草安正和中，調和諸藥。諸藥配伍，共奏燥濕清熱、解表清里、涼血止痢、祛腐生新的功效，調和脾胃，虛實兼治。現代藥理學研究表明，葛根素、黃芩苷及黃連素均可有效升高外周血中抗炎因子水平，同時減少促炎因子生成，具有顯著抗炎作用[12-14]。張寧等[15]在常規治療的基礎上，聯合使用加味葛根芩連湯治療重度濕熱型潰瘍性結腸炎患者，效果滿意。

研究發現，RORγt、Foxp3分別是調控Th17、Treg細胞分化的重要轉錄因子，且具有特異性[16]。RORγt表達異常降低時，Th17與其釋放的IL-17表達將明顯降低，而當其表達升高時，CD4+T細胞無需被外來細胞因子誘導即能表達IL-17。Foxp3特異性表達于CD4+CD25+Tregs中，通過分泌TGF-γ、IL-10等抑制性細胞因子、細胞間接觸抑制等途徑維持自身免疫耐受，發揮抗炎作用。本研究結果顯示，葛根芩連湯各劑量組可降低結腸組織中RORγt蛋白表達，上調Foxp3表達，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，表明葛根芩連湯可能通過影響RORγt、Foxp3表達，從而調節Th17/Treg平衡，減輕結腸組織病理變化，并表現為一定的劑量關系。