丹酚酸A對干擾素γ和TRAIL聯合誘導的HaCaT細胞的影響及其機制

王 靜，鄧慶華

(1.江蘇醫藥職業學院藥學院，江蘇 鹽城 224005；2.重慶醫藥高等專科學校藥學院，重慶 401331)

特應性皮炎是一種多功能、異質性的慢性炎癥性皮膚病，因其遺傳和化學過敏原等多種環境因素的復雜相互作用，其臨床表現各異[1]。常用的治療特應性皮炎的藥物是抗炎皮質類固醇。然而，這些類固醇的長期使用可引起皮膚萎縮和全身不良影響[2]。因此，需要開發副作用低的新天然候選物來治療和緩解該病。丹酚酸A是從中藥丹參中提取的一種具有生物活性的多酚化合物[3]。研究表明，丹酚酸A是一種具有多種藥理活性的多靶點藥物，如抗氧化、抗炎癥、抗纖維化、抗血小板劑和抗血栓[4-6]。丹酚酸A抑制過氧化氫誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷[7]，其對缺血再灌注急性期腦具有保護作用[8]。核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路在多種炎癥性皮膚病的發病機理中起關鍵作用[9]。然而丹酚酸A在干擾素γ(IFN-γ)和TRAIL聯合誘導的人皮膚HaCaT細胞損傷中的功能，及其是否通過NF-κB信號通路發揮作用目前仍不清楚。基于此，本研究構建IFN-γ和TRAIL聯合誘導的人皮膚HaCaT細胞損傷模型[10-11]，考察了丹酚酸A對細胞增殖、凋亡和炎癥因子分泌的影響，并評估了丹酚酸A在HaCaT細胞損傷過程的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物與試劑 人皮膚HaCaT細胞購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)。丹酚酸A(純度≥98%)購自成都曼斯特生物公司。高糖DMEM培養基購自美國Gibco公司；IFN-γ、TRAIL購自美國PeproTech公司；佛波酯購自美國Sigma公司；白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-1β(inter leukin-1β，IL-1β)酶聯免疫(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自美國eBioscience公司；異硫氰酸熒光素標記的膜聯素Ⅴ/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved caspase-3)、IκBα、磷酸化IκBα(p-IκBα)、NF-κB p65和磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)一抗購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 細胞培養 HaCaT細胞于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素高糖DMEM培養基中培養后，在37 ℃、5% CO2、濕潤環境中繼續培養。

1.3 MTT檢測HaCaT細胞活性 收集對數生長期的HaCaT細胞接種于96孔板，接種密度為1×104/孔，37 ℃孵育24 h，分別加入2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L丹酚酸A[8]，同時將不含丹酚酸A的細胞作為正常培養組，繼續培養24、48、72 h。處理結束后，加入5 mg/mL MTT溶液10 μL反應4 h，然后加入150 μL二甲基亞砜，搖床振蕩10 min溶解結晶，酶標儀檢測波長490 nm處光密度(OD)值。細胞存活率=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4 細胞處理與分組 MTT篩選出最佳丹酚酸A給藥濃度(10 μmol/L)后，將細胞HaCaT隨機分為正常培養組(正常培養的細胞HaCaT)、IFN-γ+TRAIL組(50 μg/L IFN-γ和4 μg/L TRAIL聯合處理HaCaT細胞48 h[12])、IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A 10 μmol/L組(IFN-γ、TRAIL、10 μmol/L丹酚酸A處理細胞HaCaT)、IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A+佛波酯組(IFN-γ、TRAIL、10 μmol/L丹酚酸A、0.5 μmol/L 佛波酯處理細胞HaCaT)、IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A+PBS組(IFN-γ、TRAIL、10 μmol/L丹酚酸A、PBS處理細胞HaCaT)，給藥時先加入10 μmol/L丹酚酸A處理2 h，再進行IFN-γ、TRAIL聯合處理。處理結束后收集細胞，按“1.3”項下方法檢測HaCaT細胞的活性。

1.5 流式細胞術檢測HaCaT細胞凋亡 按“1.4”項下方法收集HaCaT細胞，調整密度為1×106/mL，重懸于緩沖液，依次加入Annexin V-FITC、PI各5 μL充分混合，混勻后于室溫避光反應，15 min后采用流式細胞儀檢測HaCaT細胞凋亡。

1.6 ELISA法檢測IL-6、IL-1β水平 按“1.4”項下方法收集HaCaT細胞，嚴格按照相關 ELISA試劑盒的步驟檢測IL-6、IL-1β水平。

1.7 Western blot檢測cleaved caspase-3、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達 按“1.4”項下方法處理細胞后，采用RIPA裂解液提取蛋白，通過BCA試劑盒定量后取30 μg蛋白樣品進行12% SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，加入cleaved caspase-3、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、β肌動蛋白(β-actin)一抗(1∶1 000)，在4 ℃下過夜孵育，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記二抗(1∶5 000)孵育2 h，使用ECL增強發光液顯色，曝光，以β-actin為內參蛋白，采用Image J軟件分析各蛋白條帶。

2 結果

2.1 丹酚酸A對HaCaT細胞存活率的影響 如表1所示，與正常培養組比較，不同濃度丹酚酸A分別作用于人皮膚HaCaT細胞24、48、72 h，細胞存活率呈先下降后升高再下降的趨勢，以10 μmol/L丹酚酸A效果最顯著，故后續選擇該濃度進行實驗。

表1 丹酚酸A對HaCaT細胞存活率的影響

2.2 丹酚酸A對IFN-γ、TRAIL聯合處理HaCaT細胞存活率的影響 如表2所示，與正常培養組比較，IFN-γ+TRAIL組24、48、72 h細胞存活率降低(P<0.05)；與IFN-γ+TRAIL組比較，IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A 10 μmol/L組24、48、72 h細胞存活率升高(P<0.05)。

表2 丹酚酸A對HaCaT細胞存活率的影響

2.3 丹酚酸A對HaCaT細胞凋亡和炎癥因子分泌的影響 如圖1、表3所示，與正常培養組比較，IFN-γ+TRAIL組細胞凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表達、IL-6和IL-1β水平均升高(P<0.05)；與IFN-γ+TRAIL組比較，IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A 10 μmol/L組HaCaT細胞凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表達、IL-6和IL-1β水平降低(P<0.05)。

表3 丹酚酸A對HaCaT細胞凋亡和炎癥因子分泌的影響

圖1 各組HaCaT細胞凋亡(A)、cleaved caspase-3蛋白表達(B)

2.4 丹酚酸A對HaCaT細胞NF-κB信號通路的影響 如圖2、表4所示，與正常培養組比較，IFN-γ+TRAIL組p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表達升高(P<0.05)，IκBα、NF-κB p65蛋白表達無明顯變化(P>0.05)；與IFN-γ+TRAIL組比較，IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A 10 μmol/L組p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表達降低(P<0.05)，IκBα、NF-κB p65蛋白表達無明顯變化(P>0.05)。

表4 丹酚酸A對HaCaT細胞NF-κB信號通路的影響

圖2 各組HaCaT細胞IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達

2.5 佛波酯抑制丹酚酸A對HaCaT細胞的保護作用 如圖3、表5所示，與IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A+PBS組比較，IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A+佛波酯組24、48、72 h細胞存活率降低(P<0.05)，IκBα、NF-κB p65蛋白表達無明顯變化(P>0.0.5)，p-IκBα蛋白表達增加(P<0.05)。

表5 佛波酯抑制丹酚酸A對HaCaT細胞存活率的保護作用

圖3 各組細胞IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達

2.6 佛波酯促進丹酚酸A對HaCaT細胞凋亡和抑制炎癥因子分泌 圖4、表6顯示，與IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A+PBS組比較，IFN-γ+TRAIL+丹酚酸A+佛波酯組細胞凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表達及IL-6、IL-1β水平升高(P<0.05)。

表6 佛波酯促進丹酚酸A對HaCaT細胞凋亡和抑制炎癥因子分泌

圖4 各組細胞凋亡(A)、cleaved caspase-3蛋白表達(B)

3 討論

表皮的主要功能是提供屏障，保護人體免受環境因素的影響。角質形成細胞是角蛋白產生的表皮細胞，約占表皮細胞的90%[13]。角質形成細胞除了維持皮膚的生化和物理狀態，也參與各種炎癥性皮膚病的發展，其釋放炎癥介質，例如促炎細胞因子和趨化因子，以響應包括紫外線，過敏原和化學制劑在內的免疫觸發[14]。在本研究中，以體外培養的人皮膚HaCaT細胞為對象，采用IFN-γ和TRAIL聯合誘導損傷HaCaT細胞，發現丹酚酸A對細胞損傷具有一定的保護作用，并且這種保護作用與調控NF-κB途徑有關，為特應性皮炎的藥物開發提供了新的啟示。

細胞凋亡是角質形成細胞在正常和病理狀態下的另一個重要生理因素[15]。細胞凋亡是細胞死亡的一種程序化形式，它是一種嚴格調控的生化過程，通過多種與蛋白酶(如降解蛋白質的caspases)激活相關的不同機制發生。caspase-3被認為是最重要的執行因子，可被任何一種啟動子caspase(caspase-8、-9或-10)激活[16]。炎癥因子IL-1β和IL-6等過度表達與特應性皮炎相關，并參與病理反應的誘導，被認為是皮膚炎癥發病的關鍵因素[17]。本實驗中，丹酚酸A提高IFN-γ和TRAIL聯合誘導的HaCaT細胞存活率，降低細胞的凋亡率和cleaved caspase-3蛋白表達，提示丹酚酸A通過可以促進IFN-γ和TRAIL聯合損傷的HaCaT細胞增殖，并減少細胞凋亡。同時，丹酚酸A降低了IFN-γ和TRAIL聯合誘導的人皮膚HaCaT細胞中炎癥因子IL-6和IL-1β的分泌，說明丹酚酸A可以減輕人皮膚HaCaT細胞損傷后的炎癥反應。由此可見，在IFN-γ和TRAIL聯合損傷的HaCaT細胞中，丹酚酸A一方面促進細胞的增殖能力和抑制凋亡，另一方面抑制細胞中炎癥因子的分泌，從而發揮保護作用，與丹酚酸A在其他模型損傷中[7-8]的功能相符。

NF-κB家族包括被各種刺激激活的關鍵轉錄因子，如TNF-α、IFN-γ和脂多糖等[18]。刺激后，細胞質中的NF-κB復合物易位至細胞核，并參與眾多促炎基因的表達[19]。NF-κB信號通路已被證明與HaCaT細胞炎癥有關[20]，IFN-γ和TNF-α可以激活角質形成細胞中的NF-κB途徑[21]。本研究中，IFN-γ和TRAIL聯合誘導使HaCaT細胞內p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表達升高，使用丹酚酸A處理則抑制了此作用，提示丹酚酸A對IFN-γ和TRAIL聯合誘導的HaCaT細胞損傷的保護作用可能是通過抑制NF-κB信號通路活性而實現的。另外，NF-κB信號通路激活劑佛波酯能夠抑制丹酚酸A對IFN-γ和TRAIL聯合損傷的HaCaT細胞存活率的促進作用，并能促進丹酚酸A對細胞凋亡、炎癥因子分泌的抑制作用。這些結果證實，抑制NF-κB信號通路是丹酚酸A在IFN-γ和TRAIL聯合損傷的HaCaT細胞中發揮藥效的重要途徑。

總之，丹酚酸A對IFN-γ和TRAIL聯合誘導的HaCaT細胞損傷具有一定的保護效果，可以促進細胞的增殖，并抑制凋亡和細胞炎癥因子的分泌，這種保護作用可能與調控NF-κB信號通路有關。