HPLC指紋圖譜結合模式識別分析評價風濕骨痛膠囊的批間一致性

陳良妮，程雪梅，王 琳，高 武，陳 勇，王長虹*

[1.上海中醫(yī)藥大學中藥研究所，中藥標準化教育部重點實驗室，上海市復方中藥重點實驗室，上海中藥標準化研究中心，上海 201203；2.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西 南寧 530000；3.國藥集團精方(安徽)藥業(yè)股份有限公司，安徽 宣城 242000]

風濕骨痛膠囊由制川烏、制草烏、甘草、麻黃、紅花、木瓜、烏梅制成的中藥復方制劑，具有溫經散寒、通絡止痛的功效，用于寒濕閉阻經絡所致的弊病，風濕性關節(jié)炎等[1-4]。2015年版《中國藥典》對麻黃進行了TLC鑒別、HPLC含量測定；對制川烏、制草烏進行了TLC限量檢測及紫外分光光度法測定烏頭總生物堿。相關文獻利用液質聯(lián)用技術對方中制川烏、制草烏的9個烏頭類生物堿做了定量研究[5]。

指紋圖譜是基于對中藥及中藥制劑物質量群整體作用的認識，通過中藥化學成分的光譜或色譜圖，實現鑒別中藥及中藥制劑真實性，評價質量一致性和產品穩(wěn)定性[6-9]。化學模式識別技術可以對具有模糊性和整體性的中藥指紋圖譜實現數據降維、識別和分類，是篩選質量差異標志物的重要數學方法，具有較高的預測精度和較強的線性數據分析分類等優(yōu)勢，如主成分分析(principalcomponent analysis，PCA)、偏最小二乘法-判別分析(partial least squares discriminantanalysis，PLS-DA)、判別分析(discriminantanalysis，DA)、偏最小二乘法-判別分析(partial least squares discriminantanalysis，PLS-DA)等，已廣泛應用于指紋圖譜等多維數據的處理分析中[10-13]。目前，采用指紋圖譜結合化學模式識別技術評價不同批次風濕骨痛膠囊的質量穩(wěn)定性研究還未見報道。本實驗通過建立指紋圖譜結合化學模式識別技術分析評價風濕骨痛膠囊的質量穩(wěn)定性和批次一致性。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent G1315C DAD檢測器、Agilent Open Lab CDS 2.x化學工作站(美國Agilent公司)；AE200電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；SK1200H超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；Milli-Q Intergral水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 試劑與藥物 磷酸、乙腈為色譜純(美國Fisher公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純。鹽酸麻黃堿(批號171241-201809，純度>98%)、鹽酸偽麻黃堿(批號171237-201510，純度>98%)對照品購于中國食品藥品檢定研究院；苯甲酰新烏頭原堿(批號DST191023-056，純度>98%)、芹糖甘草苷(批號DST191102-139，純度>98%)對照品購于樂美天醫(yī)藥/德思特生物公司；綠原酸(批號AF7070309，純度>98%)、甘草素(批號AF8052202，純度>98%)對照品購于成都埃法生物科技有限公司；甘草苷(批號070003-201602，純度>98%)、異甘草苷(批號250026-201511，純度>98%)、甘草酸單銨(批號070020-201508，純度>98%)對照品購于上海奈啟生物科技有限公司。風濕骨痛膠囊共20批，由國藥集團精方(安徽)藥業(yè)股份有限公司提供，批號分別為180107、180201、180408、180501、180503、180504、180602、181206、190101、190103、190105、190106、190108、190302、190303、190304、190306、190307、190310。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm(0～20 min)、310 nm (20～36 min)、235 nm (36～60 min)；進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 稱取各對照品適量，70%甲醇溶解，即得(質量濃度分別為鹽酸麻黃堿134.6 μg/mL、鹽酸偽麻黃堿228.7 μg/mL、綠原酸18.30 μg/mL、苯甲酰新烏頭原堿45.30 μg/mL、芹糖甘草苷36.40 μg/mL、甘草苷117.9 μg/mL、異甘草苷31.50 μg/mL、甘草素17.80 μg/mL、甘草酸132.3 μg/mL)。

2.2.2 供試品溶液制備 取裝量差異項下膠囊內容物，研細，取約0.8 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，稱定質量，超聲(功率250 W、頻率40 kHz)處理30 min，放冷，70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，以甘草酸峰為參照，測得共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別在0～0.62%、0.12%～2.85%范圍內，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取同一批膠囊裝量差異項下內容物，研細，平行6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，以甘草酸為參照，測得共有峰保留時間、相對峰面積RSD分別在0.01%～0.33%、0.28%～4.73%范圍內，表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批膠囊裝量差異項下內容物，研細，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，以甘草酸峰為參照，測得共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別在0.01%～0.23%、0.12%～3.71%范圍內，表明溶液在室溫下24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.4 相對保留時間、相對峰面積 20批樣品中共有峰相對保留時間RSD在0.01%～0.49%范圍內，表明其相對穩(wěn)定；相對峰面積RSD在3.74%～71.78%范圍內，表明其差異較大。

2.4 HPLC指紋圖譜建立

2.4.1 圖譜生成 取20批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，將相關數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”軟件，設置時間窗寬度為0.2 min，采用多點校正法進行全峰匹配，共確定31個共有峰，見圖1。

圖1 20批樣品HPLC指紋圖譜

2.4.2 共有峰指認和參照峰選擇 吸取“2.2”項下對照品、供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖2。通過文獻查閱，指認出2號峰為原兒茶酸；通過DAD檢測器紫外吸收值比對，指認4號峰為鹽酸麻黃堿，5號峰為鹽酸偽麻黃堿，8號峰為綠原酸，12號峰為芹糖甘草苷，13號峰為甘草苷，15號峰為苯甲酰新烏頭原堿，17號峰為異甘草苷，19號峰為甘草素，22號峰為甘草酸，再選擇與相鄰色譜峰分離效果良好、保留時間穩(wěn)定的22號峰(甘草酸)作為參照。

2.4.3 相似度分析 將20批樣品相關數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012版)軟件，以對照圖譜為參照[14]，計算相似度，結果見表2。

4.鹽酸麻黃堿 5.鹽酸偽麻黃堿 8.綠原酸 12.芹糖甘草苷 13.甘草苷 15.苯甲酰新烏頭原堿 17.異甘草苷 19.甘草素 22.甘草酸圖2 對照品(A)、供試品(B)HPLC色譜圖

表2 20批樣品相似度

2.5 化學模式識別分析

2.5.1 主成分分析(PCA)將共有峰數據導入SIMICA13.0軟件，進行無監(jiān)督的PCA分析[15]，結果見圖3。由此可知，20批樣品可分為2類，區(qū)分度較為明顯。

圖3 20批樣品PCA得分圖

2.5.2 偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)將共有峰數據導入SIMCA13.0軟件，在PCA分析的基礎上建立有監(jiān)督的PLS-DA判別分析，獲得PLS-DA得分圖、VIP圖、聚類分析圖，分別見圖4～6。由圖4可知，20批樣品可分為2個區(qū)域。由圖5可知，5號峰為偽麻黃堿，19號峰為甘草素，14號峰為麻黃堿，22號峰為甘草酸，15號峰為苯甲酰新烏頭原堿，13號峰為甘草苷，2號峰為原兒茶酸，貢獻值均大于1；11號峰是制川烏、制草烏、紅花、烏梅的共有峰，7號峰是木瓜、烏梅的共有峰，27、30號峰來自甘草，3號峰是制川烏、制草烏共有峰，6號峰來自紅花，均對分類有顯著影響，即為主要成分的質量標志物。由圖6可知，20批樣品可聚為2大類，與圖4一致。

圖4 共有峰PLS-DA得分圖

圖5 共有峰VIP圖

圖6 20批樣品聚類分析圖

3 討論

本實驗對樣品處理方法進行考察，確定以70%甲醇超聲提取30 min制備供試品溶液。再對檢測波長進行考察，發(fā)現210 nm(0～20 min)、310 nm(20～36 min)、235 nm(36～60 min)的分段程序檢測效果最佳。

20批風濕骨痛膠囊的HPLC指紋圖譜中確定31個共有峰，指認出麻黃堿、甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿等10種成分。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012版)軟件分析，結果相似度均大于0.95，說明風濕骨痛膠囊質量穩(wěn)定。但PCA、聚類分析和PLS-DA均將20批樣品明顯分成2類，結合化學模式識別方法結果，說明不同批次樣品共有峰存在一定的差異。調取生產批記錄分析發(fā)現，20批樣品中編號為1～8的采用不同批次的原料藥材，而編號為9～20的采用同一批次的原料藥材，指紋特征也具有更高的相似性，即該產品的制備工藝具有較高的穩(wěn)定性，與實驗結果完全吻合，說明原料差異對成品的影響是重要因素之一。為了保證生產過程批次間的一致性，應加強對原料藥材進行質量控制，并且對質量合格的多個批次原料藥材進行校兌后再投入生產也是可供選擇的策略之一。