山藥及麩炒山藥拉曼指紋圖譜分析

彭 艷，張麗穎，金 陽，楊 釗，陸兔林，金傳山，都述虎*

(1.南京醫科大學藥學院，江蘇 南京 211166；2.九州天潤中藥產業有限公司，湖北 武漢 430040；3.南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210046；4.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012)

山藥為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖，記載于《山海經》《神農本草經》《圖經本草》《本草綱目》《植物名實圖考》等中醫藥典籍中[1]。山藥味甘，性平，歸脾、肺、腎經，具有補脾養胃、生津益肺、補腎澀精的功效。2020年版《中國藥典》記載的山藥飲片主要有生山藥和麩炒山藥，其鑒定僅局限在性狀、顯微和薄層色譜鑒別，主要是針對山藥的真偽鑒別，但對于不同產地山藥之間的差異，特別是對山藥炮制前后的化學成分變化研究甚少，給山藥質量控制帶來了很大的困難。因此，發展一種快速簡便的分析方法，對山藥質量標準提升具有重要意義。

拉曼光譜是一種散射光譜，通過散射峰的位置和強度得到分子振動、轉動方面的信息，并應用于分子結構研究。隨著拉曼光譜技術發展，拉曼光譜的應用已經越來越廣泛，作為一種現代光學檢測分析技術被2020年版《中國藥典》四部通則收錄。近幾年來，拉曼光譜以其操作簡便、精細如“指紋”的分辨能力和不受水分干擾等優點成功應用于中藥材的無損定性鑒別[2-7]。本實驗對不同產地的山藥飲片及其麩炒前后的拉曼指紋圖譜進行分析，以期為麩炒前后山藥的質量控制提供新途徑。

1 材料

DXR激光共聚焦拉曼光譜儀(美國賽默飛公司)。山藥對照藥材(批號121137-201606)購自中國食品藥品檢定研究院；可溶性淀粉(分析純，批號20191213)購自國藥集團化學試劑有限公司。山藥及麩炒山藥選片、統片(產地河南)由湖北麻城九州中藥發展有限公司提供，其余山藥飲片購自河南、河北、廣西及安徽，見表1。山藥片經南京醫科大學藥學院陳立娜教授鑒定為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖切制而成。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 拉曼光譜條件 掃描范圍2 000～400 cm-1；10倍物鏡；激光功率24 mW，激發波長780 nm；狹縫光闌50 μm，曝光時間10 s，累積10次。

2.2 測定方法 檢測時將樣品平面置于載玻片上，使其位于拉曼光譜儀載物臺的物鏡下測定，按采集參數隨機采集樣品的拉曼光譜，計算平均光譜用于分析比較。

2.3 拉曼光譜條件優化 為獲得最佳山藥拉曼光譜圖，分別對拉曼光譜儀的激發波長、光闌類型、激光功率、曝光時間和累積次數進行實驗條件的優化。

2.3.1 激發波長選擇 取山藥對照藥材顆粒適量，固定激光功率24 mW，狹縫光闌25 μm，曝光時間2 s，累積10次，按“2.2”項下方法分別在532、633、780 nm激發波長下進行檢測。結果顯示，780 nm激發波長下山藥對照藥材的基線噪音最小，峰形最好，因此使用該波段激發光進行測定，能夠有效避免熒光對樣品拉曼信號的影響。故選擇780 nm為最佳激發波長。

2.3.2 光闌類型選擇 取山藥對照藥材顆粒適量，固定激光功率24 mW，激發波長780 nm，曝光時間2 s，累積10次，按“2.2”項下測定方法，分別在針孔光闌(25、50 μm)和狹縫光闌(25、50 μm)下進行檢測。測定結果顯示拉曼光譜儀的光闌類型對山藥光譜影響較大，狹縫光闌下光譜的分辨率明顯高于針孔光闌，且隨著狹縫寬度增大，光譜強度增強。因此本實驗中最后選擇50 μm狹縫光闌進行后續的實驗。

2.3.3 激光功率選擇 取山藥對照藥材顆粒適量，固定激發波長780 nm，光闌50 μm，曝光時間2 s，累積10次，按“2.2”項下測定方法，分別在8、16、24 mW激光功率下進行檢測。結果顯示激光功率越大，拉曼峰強度越強，因此后續實驗激光功率選擇24 mW。

2.3.4 曝光時間選擇 取山藥對照藥材顆粒適量，固定激光功率24 mW激發波長780 nm，光闌50 μm，累積10次，按“2.2”項下測定方法，分別曝光2、5、10 s對其進行檢測。結果顯示光譜采集時的曝光時間越長，拉曼峰強度越強，信噪比值越大，當積分時間為10 s時山藥對照藥材的拉曼特征峰峰形最好，基線噪音較小，再提高曝光時間，譜圖沒有明顯改善，且損害激光器的使用壽命，因此后續實驗曝光時間選擇10 s。

2.3.5 累積次數選擇 取山藥對照藥材顆粒適量，固定激光功率24 mW激發波長780 nm，光闌50 μm，曝光時間10 s，按“2.2”項下測定方法，分別累積2、5、10次進行檢測。結果顯示隨著累積次數的增加，山藥對照藥材的拉曼光譜圖基線噪音會越來越小，但累積次數過多會嚴重影響實驗時間，損害儀器壽命，綜合考量確定累積次數為10次。

2.4 山藥拉曼峰歸屬 取山藥對照藥材顆粒適量，在“2.1”“2.2”項條件下進行檢測，選取6個不同點進行掃描，得到的山藥拉曼光譜峰形、峰強度均相對穩定，見圖1。在山藥對照藥材拉曼光譜中，478、866、941、1 460 cm-1處出現明顯的特征峰；440、523、577、616、713、770、1 050、1 082、1 126、1 263、1 339、1 380 cm-1處出現較明顯的拉曼峰。這些拉曼峰反映了山藥拉曼光譜的指紋特性。和可溶性淀粉比較，發現山藥對照藥材與可溶性淀粉的拉曼特征峰峰形相似，見圖2。

圖1 山藥對照藥材拉曼光譜 (n=6)Fig.1 Raman spectra of Chinese yam for control (n=6)

圖2 山藥對照藥材與可溶性淀粉拉曼光譜比較Fig.2 Comparison of Raman spectra between Chinese yam for control and soluble starch

查閱文獻[8-10]，可知800～400 cm-1處的振動是由于糖苷環骨架的彎曲振動所造成，其中478 cm-1處的峰是由吡喃糖環的骨架振動引起，常作為直鏈淀粉與支鏈淀粉即淀粉多糖特征峰，另外其峰強度反映了多糖的聚合程度；770 cm-1處的峰是由N-甲基甲酰胺的C-C伸縮振動引起(可能有尿囊素)；1 200～800 cm-1處的振動是C-O和C-C鍵的特征伸縮振動以及糖苷鍵中C-O-C的彎曲振動，其中866 cm-1處的峰來源于C-O-C環和C-H彎曲振動，941 cm-1處的振動是由于直鏈淀粉α-1,4糖苷鍵的C-O-C的彎曲振動引起。1 500～1 200 cm-1處的振動源于氫原子的耦合，其中1 263 cm-1處與CH2OH側鏈相關，1 339 cm-1處為C-O-H彎曲振動，1 380 cm-1為CH2、C-H和C-O-H的彎曲振動，1 460 cm-1處為CH2的彎曲振動。實驗所獲得的山藥拉曼光譜峰信號，顯示了山藥中淀粉的指紋特性[8-11]。山藥對照藥材拉曼光譜特征峰振動模式歸屬，見表2。

表2 拉曼光譜譜峰位置及歸屬Tab.2 Positions and their assignments of Raman peaks for Chinese yam for control

2.5 拉曼顯微成像分析 取山藥選片1片置于樣品臺，在“2.2”項條件下進行面掃描，X軸步距為2 000 μm，Y軸步距為3 500 μm，共40個掃描點。以478 cm-1處特征峰強度繪制mapping圖，結果見圖3，掃描范圍內山藥選片表面各檢測點的峰強度均一性較好，后續實驗可在樣品表面隨機采樣收集光譜信息。

圖3 478 cm-1處山藥選片面掃描圖Fig.3 Raman mapping image of selected Chinese yam with Raman band at 478 cm-1

2.6 重復性試驗 分別取山藥選片5片，在“2.1”“2.2”項條件下，分別在5個片子中心表面進行拉曼檢測，5組山藥特征峰強度的RSD小于4.0%，拉曼位移RSD小于0.1%。

2.7 不同產地山藥拉曼光譜分析 在“2.1”“2.2”項條件下，分別對河南、河北、廣西、安徽不同產地的山藥飲片進行拉曼光譜檢測，得到拉曼光譜圖。圖4顯示，所有山藥樣品在400～1 500 cm-1的光譜范圍內均出現了明顯的指紋特征峰，不同產地的山藥飲片指紋圖譜比較基本一致，且不同產地山藥拉曼光譜峰差異不大，較難區分。為進一步擴大山藥拉曼光譜之間的差異，對各產地山藥拉曼光譜進行一階導數和二階導數轉化處理，見圖5～6。綜上結果提示，僅憑拉曼光譜很難區分不同產地山藥的差異。

圖4 不同產地山藥與可溶性淀粉的拉曼光譜Fig.4 Raman spectra of Chinese yam from different areas and soluble starch

圖5 不同產地山藥的拉曼光譜一階導數轉換Fig.5 First derivative transformations of Raman spectra of Chinese yam from different areas

圖6 不同產地山藥的拉曼光譜二階導數轉換Fig.6 Second derivative transformations of Raman spectra of Chinese yam from different areas

2.8 判別分析 采用TQ Analyst軟件(7.2.2.161版本)對河南、河北、廣西、安徽四個產地的山藥飲片拉曼光譜數據進行判別分析，以馬氏距離單位計算各樣品與各類中心之間的距離，并根據樣品與中心距離的遠近做出判別，以確定樣品屬于哪一個類別。距離值越接近零，則匹配越好。采用全模型法，選擇山藥拉曼光譜指紋區間400～1 500 cm-1，對不同產地山藥進行判別分析，每個產地的山藥飲片取10個樣本量，分析圖中，橫坐標為樣本距離河南組的馬氏距離，縱坐標為樣本距離廣西組的馬氏距離，見圖7。結果顯示，廣西山藥樣本單獨聚為一類，能夠很好地與河南、河北和安徽山藥區分開來。即通過判別分析可以有效區分廣西山藥和其他3個產地山藥。

圖7 不同產地山藥判別分析結果Fig.7 Results of discriminant analysis for Chinese yam from different areas

2.9 麩炒山藥拉曼光譜分析 取麩炒山藥飲片，對其表面和截面進行拉曼光譜檢測，結果見圖8～9，麩炒山藥飲片表面拉曼光譜熒光背景較強，478 cm-1處的特征峰是直鏈淀粉與支鏈淀粉多糖成分的有效標志，強度顯著降低，在468、491 cm-1處出現2個新的拉曼散射峰，分別為葡萄糖吡喃糖環的骨架振動。為進一步分析478 cm-1處特征峰強度麩炒前后的變化，分別取山藥及麩炒山藥飲品各6片，進行拉曼光譜掃描，并根據其峰強度進行計算，結果顯示山藥麩炒前后峰強度降低約80%，見表3，與文獻[11]報道的總淀粉含量降低值接近，提示山藥在麩炒過程中，飲片表面的淀粉多糖發生了降解，多糖轉化為葡萄糖[12-13]，即表明山藥麩炒前后表面多糖含量及單糖組成存在差異。同時將麩炒山藥飲片切開取截面平掃，麩炒山藥截面拉曼光譜圖和同批生山藥拉曼光譜圖相比，峰位移和峰強度沒有太多變化，可見麩炒山藥內部淀粉含量沒有變化。

圖8 山藥選片和麩炒山藥選片表面與截面拉曼光譜比較Fig.8 Comparison of Raman spectra obtained on surface and cross-section of selected Chinese yam and Chinese yam stir-fried with bran

圖9 山藥統片和麩炒山藥統片表面與截面拉曼光譜比較Fig.9 Comparison of Raman spectra obtained on surface and cross-section of common Chinese yam and Chinese yam stir-fried with bran

表3 山藥與麩炒山藥飲片478 cm-1處特征峰強度分析結果(n=6)Tab.3 Analysis results of characteristic peak intensity at 478 cm-1 for Chinese yam and Chinese yam stir-fried with bran(n=6)

3 討論

本研究對各產地的山藥拉曼光譜圖分別進行一階導數、二階導數轉換處理，很難區分不同產地山藥的差異。進一步對1 500～400 cm-1指紋區間的峰進行判別分析，可以直觀區分廣西山藥和其他3個產地(河南、河北、安徽)的山藥，可能是由于廣西和其他3個產地的地域相差較遠，氣候、地質特點不同。

山藥經過麩炒后，在800～400、2 000～1 500 cm-1區域內圖譜的背景強度顯著升高，這可能是因為山藥在麥麩炮制過程中，山藥中的氨基化合物(如氨基酸)和還原糖(如葡萄糖)在常溫或加熱時發生聚合/縮合反應[14](美拉德反應)，生成類黑精等褐色物質，使麩炒山藥飲片表面顏色加深，干擾了拉曼光譜的測定。另一方面，478 cm-1處的拉曼峰常作為淀粉多糖特征峰，其峰強度反映了多糖的聚合程度，麩炒山藥表面478 cm-1處拉曼特征峰的降低，提示山藥在麩炒過程中，飲片表面的淀粉多糖發生了降解，且根據峰強度下降程度，初步得知麩炒表面淀粉降解約80%。478 cm-1處拉曼峰的強度變化，可作為山藥飲片麩炒過程中的動態變化，以期為麩炒炮制工藝提供動態監測數據。然而麩炒山藥飲片的截面卻沒有出現峰強度的降低，可見麩炒過程中淀粉的一系列反應只存在于表面。

4 結論

本研究對山藥的拉曼光譜進行方法學研究，建立了山藥拉曼指紋圖譜的分析方法，分別對8批山藥片特征圖譜進行分析，拉曼譜中出現在478、866、941、1 460 cm-1處的強峰，可認為是山藥片的特征峰。此外，發現山藥與可溶性淀粉的拉曼指紋圖譜基本一致，驗證了山藥根莖部的主要成分是淀粉。關于山藥的拉曼光譜研究雖有文獻報道[15]，但對其炮制后物料性質及主要成分變化的研究甚少。研究表明，山藥麩炒前后物料性質存在顯著差異，這為兩者的質量標準研究提供了依據。該方法不需要任何樣品前處理，具有速度快、無損及無污染等特點,是綠色的分析方法，以期為山藥及麩炒山藥飲片的質量評價標準的制訂提供參考。