白芍水煎液對類風濕性關節炎患者的臨床療效

符譯尹，蒲梅婷，潘田芬，陸志夫，于 樂

(1.三亞市人民醫院，海南 三亞 572000；2.海口市中醫醫院，海南 海口 571103；3.九江市第一人民醫院，江西 九江 332000)

類風濕性關節炎是以對稱性多關節炎病變為主的全身性炎癥性自身免疫疾病，多發于30～55歲[1-3]，其發病機制尚不明確，涉及到多個免疫系統的相關因子水平[4]，該病反復遷延性、對稱性會合并多個小關節病變[5]，而且伴隨滑膜炎、血管炎、軟骨破壞[6]，早期癥狀為關節紅、腫、熱、痛及功能障礙，晚期關節嚴重畸形，影響患者生活水平和生存質量[7-8]。芍藥干燥根中提取的糖苷類物質白芍總苷是其主要成分[9]，能通過多種途徑抑制人體自身免疫反應，有抗菌、鎮痛等作用，對類風濕性關節炎有療效[10]。NF-κB信號通路在類風濕性關節炎發病機制中有2個作用：一是活化后調動促炎相關細胞因子表達，如IL-6等；二是促進IκBα磷酸化和p65向細胞核轉運，從而加重炎癥反應[11]。本研究探討白芍水煎液對類風濕性關節炎患者的臨床療效對免疫調節功能的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 2019年1月至2020年10月收治于三亞市人民醫院的200例類風濕性關節炎患者，男性135例，女性65例，隨機分為對照組及白芍水煎液高、中、低劑量組。其中，對照組男性33例，女性16例，病程(4.9±2.2)年；白芍水煎液高劑量組男性34例，女性17例，病程(4.8±2.3)年；白芍水煎液中劑量組男性34例，女性17例，病程(4.9±2.5)年；白芍水煎液低劑量組男性34例，女性15例，病程(4.8±1.9)年，4組一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。研究經三亞市人民醫院倫理委員會批準。

1.2 納入標準 (1)符合ACR(自體細胞再生)聯合EULAR(歐洲風濕病防治聯合會)提出的類風濕性關節炎分類標準；(2)膝關節滑膜組織取自療程結束需行膝關節置換術的類風濕性關節炎患者；(3)患者了解本研究，簽署知情同意書。

1.3 排除標準 (1)合并感染；(2)合并腫瘤；(3)合并其他自身免疫性疾病。

1.4 材料 白芍(仁和大藥房)。蛋白提取試劑盒(北京天壇生物制品股份有限公司)；p-p65抗體、p-IκBα抗體、IL-6抗體、IL-17A抗體、IL-10抗體、山羊抗兔二抗(遼寧成大生物股份有限公司)；DAB顯色盒、NF-κB激活-核轉運檢測試劑盒、蘇木精染色液(上海萊士血液制品股份有限公司)；共聚焦熒光顯微鏡、石蠟切片機(上海豐實試驗儀器有限公司)。

1.5 治療手段 將80 g白芍加到500 g清水中，水煎1.5 h后得到水煎液，低、中、高劑量組患者每天每次分別口服15、30、45 mg；對照組不給予任何藥物。4組療程均為12周。

1.6 療效評價 參考文獻[12]報道，(1)顯效，晨僵、腫脹、關節疼痛等癥狀完全消失,體征、睡眠達到正常水平；(2)有效，晨僵、腫脹、關節疼痛等癥狀有所改善,體征、睡眠基本達到正常水平；(3)無效，晨僵、腫脹、關節疼痛等癥狀無顯著改善甚至加劇，體征狀況出現異常,睡眠嚴重受到影響，總有效率=[(有效例數+顯效例數)/總例數]×100%。

1.7 指標檢測

1.7.1 晨僵時間 檢測患者從早晨感受關節僵硬到恢復正常所用的時間，即為晨僵時間。

1.7.2 癥狀評分 采用疼痛數字評分法(NRS)評價患者關節疼痛程度，總分10分，分值越高，疼痛越強烈。再采用容積法評價患者關節腫脹度。

1.7.3 實驗室指標 包括血沉(ESR)、血清 C 反應蛋白(CRP)、類風濕因子(RF)，患者于每天上午7：00采集空腹肱靜脈血10 mL，離心取血清，采用XT-2000型SYSMEX 全自動血液分析儀、HITACHI 7060型全自動生化分析儀檢測上述指標。

1.7.4 檢測血清p-p65、p-IκBα、IL-6、IL-17A、IL-10水平檢測 采用Western blotting法。按照蛋白提取試劑盒說明進行操作，提取患者血清中相關蛋白，測定其濃度，SDS-PAGE分離蛋白，PVDF轉膜，脫脂牛奶封閉1.5 h，加入p-p65、p-IκBα、IL-6、IL-17A、IL-10抗體(1∶800)，在6 ℃下孵育過夜。TBST洗滌3次，每次10 min，加入HRP標記的二抗(1∶3 500)，在5 ℃下孵育1.5 h。TBST液洗滌3次，每次10 min，最后條帶經Bio-RAD凝膠分析儀進行圖像掃描分析灰度值測定，以p-p65、p-IκBα、IL-6、IL-17A、IL-10與GADPH灰度值的比值表示各蛋白相對表達量。

1.7.5 NF-κB p65核轉運檢測 采用免疫熒光染色法。取患者空腹肱靜脈血，離心取血清，重懸于培養液中，以每孔210個的密度接種于6孔板中，待細胞鋪底80%左右時吸除培養液，檢測NF-κB p65轉運，具體操作步驟按NF-κB激活-核轉運檢測試劑盒說明書進行，封片后，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.7.6 T細胞分化檢測 采用免疫組織化學法。將患者膝關節滑膜組織制成標準石蠟切片，依次在二甲苯Ⅰ中浸泡5 min、二甲苯Ⅱ中浸泡5 min、乙醇中浸泡2 min、95%乙醇中浸泡3 min、85%乙醇中浸泡3 min、75%乙醇中浸泡3 min脫蠟，蒸餾水沖洗3 min，過氧化氫-甲醇溶液中浸泡10 min，PBS沖洗3次，滴加1∶800稀釋一抗覆蓋組織，在5 ℃下孵育過夜，次日PBS沖洗5 min(共3次)，二抗在40 ℃下孵育2 h，PBS沖洗5 min，滴加DAB顯色液，自來水沖洗，蘇木精染色2～3 min，1%鹽酸酒精分化數秒，自來水返藍20 min，記錄顯色情況，中性樹膠封片，觀察染色結果。

2 結果

2.1 臨床療效 白芍水煎液各劑量組總有效率高于對照組(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見表1。

表1 4組臨床療效比較(n=50)Tab.1 Comparison of clinical efficacy among the four groups (n=50)

2.2 晨僵時間、癥狀評分 治療后，白芍水煎液各劑量組晨僵時間短于對照組(P<0.05)，關節疼痛評分、關節腫脹度評分更低(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見表2。

表2 4組晨僵時間、癥狀評分比較Tab.2 Comparison of morning stiffness time and symptom scores among the four groups n=50)

2.3 ESR、CRP、RF水平 治療后，白芍水煎液各劑量組ESR、CRP、RF水平低于對照組(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見表3。

表3 4組ESR、CRP、RF水平比較Tab.3 Comparison of ESR,CRP and RF levels among the four groups n=50)

2.4 血清p-p65、p-IκBα水平 患者給予白芍水煎液后，血清p-p65、p-IκBα水平明顯受到抑制，并呈劑量依賴性，見圖1。

圖1 4組血清p-p65、p-IκBα水平Fig.1 Serum p-p65 and p-IκBα levels in four groups

2.5 NF-κB p65核轉運 對照組NF-κB p65大多位于細胞核中，少數位于細胞質中；白芍水煎液各劑量組NF-κB p65水平在細胞核內逐漸減少，并呈劑量依賴性，見圖2。

圖2 4組NF-κB p65核轉運Fig.2 NF-κB p65 nuclear transports in four groups

2.6 T細胞分化 白芍水煎液高劑量組Th17細胞數量少于對照組(P<0.05)，而Treg細胞數量增加(P<0.05)；患者給予白芍水煎液后，T細胞向Th17細胞的分化減少，T細胞向Treg細胞的分化增加，使原本失調的免疫調節功能得到一定恢復(P<0.05)，見圖3。

注：A為對照組Th17細胞，B為白芍水煎液高劑量組Th17細胞，C為對照組Treg細胞，D為白芍水煎液高劑量組Treg細胞。圖3 2組T細胞分化Fig.3 T cell differentiation in two groups

2.7 IL-6、IL-17A、IL-10水平 白芍水煎液各劑量組IL-6、IL-17A水平低于對照組(P<0.05)，IL-10水平更高(P<0.05)，見表4。相關性分析顯示，IL-6水平與IL-17A水平呈正相關關系，而IL-6水平與IL-10水平呈負相關關系，見圖4。

表4 4組IL-6、IL-17A、IL-10水平比較Tab.4 Comparison of IL-6,IL-17A and IL-10 levels among the four groups n=50)

注：A為Western blotting檢測IL-6、IL-17A、IL-10水平，B、C分別為IL-6水平與IL-17A、IL-10水平的相關性分析。圖4 4組IL-6、IL-17A、IL-10水平及相關性分析Fig.4 IL-6,IL-17A and IL-10 levels in four groups and correlation analysis

3 討論

類風濕性關節炎是集骨纖維化、骨質破壞、軟骨吸收、慢性炎性反應于一身的慢性自身免疫性疾病，主要病因是體內缺乏內源性糖皮質激素[13]，臨床治療大多采用非甾體消炎藥、免疫抑制類藥物，同時內源性腎上腺皮質激素也有抗炎效果[14]。NF-κB是類風濕性關節炎進展的炎性信號轉導通道，可激活IκBα磷酸化，增加抗炎性p65活性及下游促炎因子IL-6表達，并聯動其他炎癥因子表達[15-16]。健康人體內的T細胞穩態平衡，而患上類風濕性關節炎后其穩態平衡打破，細胞過度的向促炎性的T細胞亞群分化。目前，大量學者從人體自身免疫調節出發，尋找治療類風濕性關節炎的藥物靶點[17-18]，并且分析白芍在治療類風濕性關節炎方面有優勢[19-20]。

本研究發現，白芍水煎液干預后類風濕性關節炎患者總有效率顯著提升，臨床不良癥狀顯著減輕，并呈劑量依賴性；患者血清p-p65、p-IκBα表達受到抑制，并呈劑量依賴性，說明調節過程與NF-κB信號通路相關；膝關節滑膜組織中的促炎細胞Th17較對照組顯著減少，抑炎細胞Treg顯著增加，表明T細胞向Th17細胞的分化減少，向Treg細胞的分化增加，免疫調節功能增強；患者血清IL-6、IL-17A表達較對照組顯著降低，IL-10表達顯著升高；IL-6表達與IL-17A表達呈正相關，與IL-10表達呈負相關，表明白芍水煎液通過下調NF-κB信號通路來抑制Th17細胞分泌的促炎性細胞因子IL-17A，促進Treg分泌的抗炎性細胞因子IL-10，從而增強免疫調節功能。

綜上所述，白芍水煎液可改善類風濕性關節炎患者臨床癥狀，增強免疫調節功能，對病情進展有阻斷作用，臨床應用前景較好。但其他炎性細胞(如漿細胞等)在類風濕性關節炎中的作用尚不明確，需作進一步探索。