基于網絡藥理學探究當歸四逆湯抗多囊卵巢綜合征的藥理作用與機制

于 丹，底雪梅，張其鏘，王 菲，張 海，李 偉*

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2.同濟大學附屬第一婦嬰保健院藥劑科，上海 201204)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是青春期及育齡期女性最常見的一種內分泌紊亂性疾病，其發生率占育齡婦女的5%～10%，在不孕癥患者中發病率可達50%～70%[1-2]。在臨床治療方面，通常采用抗雄激素治療，二甲雙胍、噻唑烷二酮類藥物等[3]，但并沒有形成規范統一的治療方案。中醫藥在治療PCOS方面有其天然的優勢，特別是中藥復方可以從整體宏觀的角度，通過多成分多靶點多途徑協同拮抗起到治療作用。

當歸四逆湯為漢代張仲景所作經典名方，出自《傷寒論》厥陰篇中，是治療厥陰傷寒的代表方劑[4]。當歸四逆湯由當歸、桂枝、芍藥、細辛、通草、大棗、甘草(炙)等熬制而成[5]。近年來有關當歸四逆湯臨床研究表明，當歸四逆湯可治療子宮內膜異位癥、盆腔炎性等婦科疾病，特別對PCOS療效確切[6-8]。但有關當歸四逆湯的藥理作用機制的研究報道較少，其有效成分、作用靶點及分子作用機制還不明確。

網絡藥理學是系統生物學研究的一部分，其整體觀和系統理論與中藥復方配伍作用機制完全一致，所以是研究中藥復方配伍作用和藥理作用機制的有效技術方法，近年來在業內得到廣泛應用[9-10]。本研究以當歸四逆湯為研究對象，通過構建大鼠PCOS病理模型，評價當歸四逆湯的藥理作用；然后收集主要活性成分和作用靶點，利用Cytoscape軟件構建“成分-靶點”交互作用網絡，然后進行GO與KEGG功能富集分析；最后，采用Discovery Studio對主要藥效成分和作用靶點進行分子靶點對接，并對當歸四逆湯抗PCOS的分子作用機制進行探討。這將為當歸四逆湯進一步的配伍機制研究和臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 當歸、桂枝、生白芍、細辛、蜜炙甘草、通草、大棗均購自上海康橋中藥飲片有限公司。來曲唑片(批號19991001)，規格2.5 mg/片，購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。4%多聚甲醛(批號G-1002)購自武漢谷歌生物科技有限公司。石蠟切片機(型號RM2235，德國Leica公司)；光學顯微鏡(型號IX70，日本Olympus公司)；電子分析天平(型號JA5003N，上海菁華科技儀器有限公司)。SPF級6周齡SD雌性大鼠，動物生產許可證號SCXK(京)2016-0006，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養在同濟大學實驗動物中心。

1.2 模型建立 50只大鼠每日灌胃給予來曲唑(1 mg/kg)，連續21 d，解剖大鼠可觀察到其卵巢表面蒼白，包膜增厚明顯，體積增大，光鏡下可見較多閉鎖卵泡，囊泡擴張增加，顆粒細胞層減少，黃體數量下降，說明造模成功。

1.3 分組及給藥 稱取當歸40 g、桂枝30 g、生白芍30 g、細辛10 g、蜜炙甘草20 g、通草20 g、大棗10 g，8倍量85%乙醇超聲提取(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，分離藥液，生藥量1.0 g生藥/mL。大鼠隨機分為正常對照組、模型組、當歸四逆湯低劑量組(每天6 g/kg)、當歸四逆湯高劑量組(每天9 g/kg)、克羅米芬組(每天15 mg/kg)，每組10只，正常對照組、模型組給予等容量生理鹽水，均連續15 d。

1.4 卵巢組織病理切片 末次給藥后禁食24 h，大鼠頸椎脫臼處死，取新鮮卵巢，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋常規切片，HE染色，在光學顯微鏡觀下察大鼠卵巢組織病理切片形態學變化。

1.5 當歸四逆湯成分和靶點數據庫構建 通過中藥系統藥理學分析平臺TCMSP(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)，以OB≥30%，DL≥0.18為篩選條件，得到當歸四逆湯的活性成分，并檢索其藥物靶點。通過NCBI PubChem數據庫(www.NCBI.nlm.nih.gov/pccompound)查找活性成分的SMILES結構，利用Uniprot(https：//www.uniprot.org/)數據庫對檢索到的藥物靶點進行標準化處理，限定物種為“Homo-Sapiens”，將藥物作用靶點名稱轉換成對應基因名稱。以“PCOS”為關鍵詞，在DrugBank(www.drugbank.ca)和Genecards(https：//www.genecards.org/)數據庫中檢索與PCOS相關的靶點，刪除重復靶點，利用Uniprot數據庫將其轉換成對應基因，最后篩選得到藥物與疾病兩者的交集作用靶點。

1.6 當歸四逆湯成分靶點交互作用和作用機制研究 采用Cytoscape 3.6.1軟件，構建當歸四逆湯成分-疾病-靶點交互作用網絡圖。利用“Network Analysis”功能進行網絡拓撲屬性分析，依據度值大小篩選分析關鍵化合物。采用DAVID數據庫，對交集作用靶點進行GO生物學過程分析和KEGG代謝通路富集分析，預測當歸四逆湯作用于PCOS的分子作用機制。采用Discovery studio 3.0分子對接軟件建立藥物分子與靶點的相關性，首先篩選靶結構均為X射線測定的晶體結構，隨后將其導入到Discovery Studio 3.0中，初步預處理后，通過加氫除水和結構簡化優化各個結構，同時將化合物SMILES式導入軟件構建分子結構，最后將每個分子與靶點結構對接，獲得dock參數Xlibdockscore，生成配體-蛋白相互作用三維和二維平面圖。

2 結果

2.1 抗PCOS作用評價

2.1.1 大鼠體質量、卵巢質量、子宮質量 表1顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠體質量、卵巢質量增加(P<0.05)，與大多數臨床PCOS患者體質量超重或肥胖、卵巢增大相符；當歸四逆湯低、高劑量組大鼠體質量減輕(P<0.05)，表明用藥有一定效果。模型組及當歸四逆湯低劑量組大鼠子宮質量較低，當歸四逆湯高劑量組大鼠子宮質量恢復正常水平(P<0.05)。

表1 各組大鼠體質量、卵巢質量、子宮質量Tab.1 Weights of bodies,ovarians and uterines of rats in each

2.1.2 大鼠卵巢卵泡數及黃體數 與正常對照組比較，模型組大鼠生長卵泡數增加(P<0.05)，成熟卵泡數及黃體數均減少(P<0.05)，提示造模成功；與模型組比較，當歸四逆湯低、高劑量組大鼠成熟卵泡數及黃體數升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠生長卵泡、成熟卵泡、黃體數Tab.2 Growing follicles，mature follicles and corpus luteum of rats in each

2.1.3 大鼠卵巢組織形態結構 如圖1所示，空白組大鼠卵巢組織形態和細胞結構沒有異常，可見不同發育階段的卵泡、多個黃體，形態完整，排列較為整齊；模型組大鼠卵巢組織可見大小不等的囊腔，粒層細胞被擠壓呈扁平或立方形，各種發育階段卵泡與黃體稀少；與模型組比較，當歸四逆湯低劑量組(6 g/kg)、克羅米芬組大鼠卵巢病理性改變減輕。

圖1 各組大鼠卵巢組織切片HE染色(×100)Fig.1 HE staining for ovarian tissue sections of rats in each group(×100)

2.2 當歸四逆湯成分和靶點數據庫構建 在TCMSP數據庫中，檢索到當歸四逆湯化學成分967種，經OB、DL值篩選得到155種，其中當歸2種，桂枝7種，白芍13種，細辛8種，通草4種，甘草92種，大棗29種，刪除39種無作用靶點的化合物，最終得到116種成分，對應1 791個靶點，重復靶點僅保留1個，共得到282個單一靶點。以“PCOS”為關鍵詞進行檢索，在DrugBank和Genecards數據庫中搜索相關靶點，刪除重復靶點，最終得到疾病靶點2 282個。將282個藥物靶點與2 282個疾病靶點進行交集，發現有166個靶點重合。

2.3 核心靶點蛋白互作網絡構建 將166個共同作用靶點導入STRING數據庫中，繪制相關靶點PPI網絡圖，見圖2，設置置信度為0.9，PPI圖中有40個節點，80條邊，期望邊數為19，PPI的富集顯著性P<1.0×10-16。節點代表藥物治療PCOS的作用靶點，邊代表靶點與靶點之間有相互作用，說明這些靶點在某些方面是相互關聯，協同配合起到治療疾病的作用。導出含有節點信息的TSV文件，在Cytoscape中分析節點信息，篩選出前14個核心調控基因靶點，結果見表3。

表3 關鍵靶點基因的拓撲學分析Tab.3 Topological analysis for key target genes

圖2 核心靶點蛋白互作網絡圖Fig.2 Network diagram for Protein-protein interaction of core targets

2.4 “成分-靶點-疾病”網絡圖構建 116種活性成分用C1-C116表示，40個作用靶點用相應基因代號表示，利用Cytoscape 3.6.1軟件構建“成分-靶點”相互作用網絡，見圖3。該網絡圖包含157個節點，1 558條邊，可直觀體現當歸四逆湯治療PCOS的多成分、多靶點的作用特點。再進行網絡拓撲屬性分析，依據度值大小篩選出排名前10的潛在重要活性成分，見表4。

表4 當歸四逆湯主要活性成分Tab.4 Main active ingredients in Danggui Sini Decoction

2.5 生物過程與通路分析 生物過程分析主要涉及一氧化氮生物合成過程的正向調控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控、藥物反應、細胞對有機循環化合物的反應、NF-κB轉錄因子活性的正調控及凋亡過程的正向調控等，結果見圖4A。由此可知，在細胞組成和分子功能方面，主要集中在細胞質溶膠、膜筏和線粒體外膜中，涉及了酶結合、蛋白質同源二聚化結合、類固醇激素受體結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性，配體激活序列特異性DNA結合、蛋白結合等。

通過對40個關鍵靶點進行KEGG信號通路分析，共得到82條信號通路(P<0.05)，選取其中排名前20者繪制氣泡圖，進行可視化分析，見圖4B。由此可知，共同靶點主要富集于TNF、Toll樣受體信號通路、細胞凋亡、甲狀腺激素信號通路、神經鞘脂類信號通路、缺氧誘導因子(HIF-1)信號通路等。

注：紅色三角形代表當歸四逆湯中活性成分，藍綠色圓角矩形代表蛋白靶點。圖3 成分-靶點交互作用網絡圖Fig.3 Network diagram for Component-Target interaction

圖4 生物學過程(A)、KEGG富集分析(B)氣泡圖Fig.4 Bubble diagrams for biological process(A)and KEGG enrichment analysis(B)

2.6 分子對接結果 將當歸四逆湯治療多囊卵巢綜合征的潛在活性成分和PPI分析中的核心靶點分別對接，發現不少化合物能與ESR1、NCOA2、NOS2、CASP8、PPARG、BCL2、IL6對接成功，選取代表性成分異鼠李素(isorhamnetin)、槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、甲氧基菜豆素(1-methoxyphaseollidin)，采用分子對接和二維相互作用圖進行分析驗證，結果如圖5所示。由此可知，異鼠李素中的羥基與PPARG中的PHE360形成氫鍵，槲皮素中的羥基與BCL2中的VAL133形成氫鍵，山柰酚中的兩個羥基分別與CASP8中的THR337、GLU396形成氫鍵，甲氧基菜豆素中的一個氧原子與IL6中的GLN175、ARG179形成共軛π鍵，表明當歸四逆湯活性成分預測的作用靶點具有一定的準確性，可以用于后續實驗。

圖5 “活性成分-作用靶點”分子對接圖Fig.5 Diagram for ‘active ingredient s-targets’molecular docking

3 討論

多囊卵巢綜合征是一種以高雄激素血癥、排卵障礙、胰島素抵抗及糖脂代謝異常為基本特征的綜合病癥，其發病因素復雜，主要包括下丘腦-垂體-卵巢軸調節功能紊亂、機體胰島素抵抗造成內分泌紊亂等[11-12]。在分子生物學水平，相關信號通路的失衡或者關鍵基因的異常表達也可以導致PCOS的發生[13]。本研究首先進行了藥理學實驗驗證了當歸四逆湯可以有效改善大鼠多囊卵巢綜合征，并基于網絡藥理學的方法，根據當歸四逆湯中藥材組成建立成分-靶點數據庫，經網絡圖分析，篩選獲得潛在活性成分槲皮素、山柰酚、植物甾醇、異鼠李素、甘草黃酮等，其中槲皮素能夠改善PCOS胰島素抵抗，抑制TLR/NF-κB通路，改善PCOS炎癥微環境，逆轉胰島素抵抗[14]；山柰酚能夠激活AMPK/HO-1信號通路，減輕氧化應激及細胞凋亡，降低炎癥反應[15]；異鼠李素具有一定的降血糖活性，還可以抑制血小板聚集，調控一氧化氮合酶活性發揮抗炎作用[16]；其余的活性成分大多為黃酮類化合物，具有抗炎、降低血脂、改善凝血等作用，能發揮抗炎、抗氧化功能。經網絡拓撲屬性分析篩選出AKT1、ESR1、BCL2、TNF、IL-6等14個關鍵靶點，推測可能是當歸四逆湯活性成分的主要作用靶點。ESR1是一種配體激活的轉錄因子，該基因編碼雌激素受體，在卵泡發育和成熟中發揮至關重要的作用[17]。AR屬于核受體超家族成員，是編碼雄激素受體的基因，PCOS的病理特征之一就是雄激素水平升高，較高的雄激素水平可以引起 PCOS患者的痤瘡、多毛等癥狀。IL-6基因是趨化因子家族的一種細胞因子，廣泛參與炎癥反應，IL-6水平升高可以加重PCOS胰島素抵抗[18]。AKT基因在細胞存活和凋亡中起重要作用，胰島素等生長和存活因子都可以激活AKT信號途徑，研究表明，胰島素水平缺陷和胰島素抵抗與PCOS卵巢和子宮內膜中PI3K/AKT/mTOR信號受損有關[19]，這一途徑通常與細胞增殖和細胞炎癥反應密切相關，AKT基因是其中的關鍵靶點。綜上所述，當歸四逆湯可能是通過調控ESR1、AR、IL-6、AKT等關鍵靶點，介導基因轉錄調節、炎性微環境、細胞凋亡與胰島素抵抗等信號途徑達到治療多囊卵巢綜合征的作用。

GO和KEGG分析結果涉及一氧化氮生物合成過程的正向調控、對類固醇激素反應、NF-κB轉錄因子活性的正調控及凋亡過程的正向調控等，涉及信號分子、轉錄因子、受體、蛋白和酶等多種物質的參與,可能通過調控TNF、Toll樣受體、細胞凋亡等信號通路，是一個復雜的生物學過程。類固醇激素包括性激素、腎上腺皮質激素等，其在糖脂代謝、胰島素抵抗、慢性炎癥等多途徑發揮調節作用，類固醇激素反應在PCOS的發生發展中扮演重要角色，多途徑的參與調節PCOS患者體內微環境[20]。經KEGG分析，TNF信號通路上富集的基因主要有AKT1、IL-6、TNF、CASP8等，TNF、NF-κB信號通路的激活在PCOS的發生發展過程中也起到重要作用。TNF-α是一種與炎癥有關的細胞因子，其能夠誘導NF-κB結合雄激素受體啟動子，激活炎癥信號通路，使IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子水平升高，增加卵巢局部雄激素表達，誘導PCOS[21]，有研究顯示，當歸四逆湯可以降低類風濕性關節炎模型大鼠外周血清TNF-α、IL-6、IL-1β的水平，改善炎癥反應[22]；Toll樣受體是參與非特異性免疫的一類重要的蛋白質分子，魏慧玲等[23]通過構建硬皮病模型小鼠發現，當歸四逆湯可通過下調Toll樣受體4(TLR4)以及NF-κB的蛋白表達，抑制TLR4/NF-κB信號通路，降低炎癥因子TNF-α、IL-10 及 IL-16表達。張汝堅等[24]實驗證實IL-6在PCOS患者中高表達，其可能是通過胰島素抵抗或引發慢性炎癥在PCOS發病中起作用。本研究通過分析，發現IL-6、TNF等是當歸四逆湯治療PCOS的潛在靶點，結合既往實驗研究，進一步推測當歸四逆湯可能是通過調控TNF、NF-κB、Toll樣受體信號通路中IL-6、TNF等作用靶點來抑制炎癥反應、調節脂質代謝和細胞凋亡、改善胰島素抵抗等多途徑來達到治療PCOS的目的。

綜上所述，本研究對當歸四逆湯抗PCOS藥理作用進行了評價，對其藥理作用機制進行了初步研究探索，結果表明，當歸四逆湯可以有效改善大鼠多囊卵巢癥狀，采用網絡藥理學的方法，對中藥復方當歸四逆湯治療PCOS進行了系統分析，說明當歸四逆湯是通過多成分、多靶點、多通路協同發揮抗PCOS藥理作用的，為當歸四逆湯臨床應用提供了新思路，也為進一步實驗研究奠定了基礎，以期可以使更多的多囊卵巢綜合征患者受益。