刺芒柄花素對糖尿病腎病大鼠腎臟氧化應激損傷的作用及機制

張馨允，郭啟倉，張景義，許 穎

(1.河北省唐山市開灤總醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 唐山 063000；2.華北理工大學附屬醫(yī)院心胸血管外科，河北 唐山 063000)

糖尿病腎病是糖尿病患者死亡增加的主要原因，也是造成終末期腎病的常見原因[1]，其病理特點是腎小球肥大、基底膜增厚、腎小球系膜擴張、腎小球硬化和間質(zhì)纖維化[2]。氧化應激是糖尿病的重要致病因素，通過損傷胰島β細胞和降低外周組織對胰島素的敏感性，導致糖尿病的發(fā)生發(fā)展[3]。活性氧(ROS)作為細胞內(nèi)信使，活化多種信號傳導通路，間接導致組織和細胞的損傷，誘導糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生如糖尿病腎病[4]。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)在氧化應激防御系統(tǒng)中起著重要作用。在病理狀態(tài)下，Nrf2從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，激活下游血紅素氧合酶-1(HO-1)的表達，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)ROS水平以達到抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)[5]，激活Nrf2/HO-1信號通路能提高糖尿病腎病大鼠的抗氧化能力，說明Nrf2/HO-1信號通路介導的抗氧化在糖尿病腎病腎損傷中發(fā)揮腎保護作用。刺芒柄花素為紅車軸草中主要的異黃酮類化合物，具有抗炎抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)[6]，刺芒柄花素通過抑制氧化應激和促炎因子水平對急性腎損傷大鼠的腎毒性起一定的預防作用。因此，本研究初步探討刺芒柄花素對糖尿病腎病腎臟氧化應激損傷的保護作用及其潛在機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級8周齡雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量(250±30)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物使用許可證號SYXK(湘)2019～0017，在溫度18～26 ℃、相對濕度40%～70%、光暗交替循環(huán)12 h/12 h下適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 試劑與藥物 刺芒柄花素(純度≥98%，批號CY180215，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司)。鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ，純度≥98%，批號V900890，美國Sigma-Aldrich公司)；血肌酐(批號MAK080)、血尿素氮(批號MAK006)檢測試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA，批號A003)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，批號A001-3)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px，批號BC1190)檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；RIPA裂解液(批號P0013C)、ECL化學發(fā)光試劑(批號P0018S)和BCA蛋白分析試劑盒(批號P0012S)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；TRIzol試劑(批號15596026，美國Invitrogen Life Technologies公司)；二氫乙錠熒光染液(批號sc-204724A，美國Santa Cruz公司)；逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒(批號K1691，美國Thermo Fisher Scientific公司)；熒光定量試劑盒[批號RR420 A，寶生物工程(大連)有限公司]；一抗兔抗Nrf2(批號ab92946)、鼠抗HO-1(批號ab13248)、鼠抗β-actin(批號ab8226)和兔抗Histone H3(批號ab1791)抗體(英國Abcam公司)。

1.3 儀器 活力型血糖儀(瑞士羅氏公司)；TBA-40FR全自動分析儀(日本東芝公司)；Multiskan Sky 全波長酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；GelDoc XR凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；ABI 7500熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；RM2235石蠟切片機(德國Leica公司)；BX51熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 采用多次小劑量腹腔注射STZ(40 mg/kg)持續(xù)5 d[7]構(gòu)建糖尿病大鼠模型，造模過程中出現(xiàn)死亡或造模不成功的予以補充或剔除，注射3 d后檢測血糖，若濃度>16.7 mmol/L[8]則認定糖尿病模型建模成功，再繼續(xù)定期檢測血糖，剔除血糖緩解者并及時補充，4周后檢測大24 h尿蛋白水平，若>20 mg[9]，并且尿糖陽性，則認定糖尿病腎病模型建模成功。將造模大鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組(100 mg/kg)、刺芒柄花素低劑量組(10 mg/kg)、刺芒柄花素高劑量組(40 mg/kg)，每組15只，另選15只未經(jīng)任何處理的大鼠作為正常對照組，給藥組大鼠灌胃給予相應藥物，正常對照組、模型組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)8周。治療8周后收集大鼠24 h尿液，處死后采集腎臟組織和血液進行后續(xù)實驗。

2.2 大鼠生化指標檢測 收集各組大鼠24 h尿液，測定24 h尿微量白蛋白排泄率(MAER)。空腹尾靜脈采血，采用血糖儀檢測空腹血糖水平，肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)試劑盒檢測血清Scr、BUN水平，全自動分析儀檢測血脂水平，包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。

2.3 大鼠腎組織氧化指標檢測 取凍存于液氮中的大鼠腎組織，預冷生理鹽水制成10%組織勻漿后，按照試劑盒說明書檢測MDA水平及SOD、GSH-Px活性。

2.4 過碘酸雪夫(PAS)染色 取大鼠左腎組織，去包膜后切一半，置于4%甲醛固定液中固定，常規(guī)石蠟切片，脫蠟至水后浸入高碘酸溶液中，室溫孵育10 min，蒸餾水洗滌3次，室溫晾干，滴加Schiff染液，室溫孵育20 min，自來水沖洗5 min，蘇木素染色10 min，自來水沖洗5 min，二甲苯透明，加入中性樹膠封片，在顯微鏡下測量腎小球面積，計算腎小球基質(zhì)相對面積，公式為相對面積=(腎小球基質(zhì)面積/腎小球面積)×100%。

2.5 大鼠腎組織活性氧(ROS)檢測 取固定好的大鼠腎組織，常規(guī)制備成石蠟切片，在室溫下黑暗浸入10 μmol/L二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)溶液中孵育20 min，PBS溶液洗滌3次后，在熒光顯微鏡下觀察腎組織細胞中紅色熒光，根據(jù)紅色熒光強度可判斷ROS水平的變化情況[10]。

2.6 RT-qPCR法檢測大鼠腎組織Nrf2/HO-1 mRNA表達 取適量右腎組織，加入液氮研磨成碎塊，使用TRIzol試劑制備組織勻漿提取總RNA，取1 μg，用PrimeScript RT酶混合液反轉(zhuǎn)錄成cDNA，在85 ℃下孵育5 s。引物序列Nrf2正向5′-CCATTTACGGAGACCCAC-3′，反向5′-CTTATTTCA ACGGCGAGT-3′；HO-1正向5′-CCTCACTGGC AGGAAATCATC-3′，反向5′-CCTCGTGGAGACGC TTTACATA-3′；β-actin正向5′-ATGAAGTGTGACG TTACGC-3′，反向5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGC AC-3′。采用ABI 7500實時PCR系統(tǒng)進行檢測，反應條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次，以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計算目的基因表達的相對量。

2.7 Western blot法檢測大鼠腎組織Nrf2/HO-1蛋白表達 取適量大鼠右腎組織至玻璃勻漿器中，每20 mg加入150 μL RIPA裂解液裂解組織抽提總蛋白，加入胞核提取緩沖液提取組織核蛋白，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，BCA蛋白分析試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上，在室溫下用含5%脫脂奶粉的PBS溶液封閉1 h，加入一抗抗體Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)、Histone H3(1∶2 000)，4 ℃過夜孵育，PBS溶液清洗3次，在室溫下與辣根過氧化物酶結(jié)合的二級抗體孵育1 h，PBS溶液洗滌3次，增強化學發(fā)光液(ECL)顯影，以目標條帶、內(nèi)參條帶灰度值的比值為相對蛋白表達量，分別以β-actin、Histone H3為內(nèi)參。

3 結(jié)果

3.1 刺芒柄花素對糖尿病腎病大鼠腎功能的影響 如表1所示，與正常對照組比較，模型組大鼠24 h尿液MAER、血清Scr和BUN水平升高(P<0.01)；與模型組比較，刺芒柄花素高劑量組、二甲雙胍組大鼠24 h尿液MAER、血清Scr和BUN水平降低(P<0.01)，而刺芒柄花素低劑量組大鼠上述指標無明顯變化(P>0.05)。

表1 刺芒柄花素對糖尿病腎病大鼠腎功能的影響Tab.1 Effects of formononetin on renal functions of rats with diabetic nephropathy n=15)

3.2 刺芒柄花素對糖尿病腎病大鼠血糖及血脂的影響 如表2所示，與正常對照組比較，模型組大鼠空腹血糖及血清TG、TC、LDL、HDL水平升高(P<0.01)；與模型組比較，刺芒柄花素高劑量組、二甲雙胍組大鼠空腹血糖及血清TG、TC、LDL、HDL水平降低(P<0.05，0.01)，而刺芒柄花素低劑量組大鼠上述指標無明顯變化(P>0.05)。

表2 刺芒柄花素對糖尿病腎病大鼠血糖、血脂水平的影響Tab.2 Effects of formononetin on blood glucose and blood lipid levels in rats with diabetic nephropathy n=15)

3.3 刺芒柄花素對糖尿病腎病大鼠腎組織病理變化的影響 如圖1A所示，正常對照組大鼠腎組織腎小球無明顯肥大增生等病理變化；模型組大鼠腎組織腎小球肥大、增生，系膜擴張以及系膜基質(zhì)增多；刺芒柄花素高劑量組、二甲雙胍組大鼠腎組織損傷病理變化較模型組減輕，而刺芒柄花素低劑量組未明顯緩解。如圖1B所示，與正常對照組比較，模型組大鼠腎小球基質(zhì)相對面積增加(P<0.01)；與模型組比較，刺芒柄花素高劑量組、二甲雙胍組大鼠腎小球基質(zhì)相對面積減少(P<0.01)，而刺芒柄花素低劑量組大鼠該指標無明顯變化(P>0.05)。

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖1 刺芒柄花素對糖尿病腎病大鼠腎組織病理變化的影響(×400)Fig.1 Effects of formononetin on renal tissue pathological changes of rats with diabetic nephropathy (×400)

3.4 刺芒柄花素對糖尿病腎病大鼠腎組織氧化指標的影響 如表3、圖2所示，與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織MDA、ROS水平升高(P<0.01)，GSH-Px、SOD活性降低(P<0.01)；與模型組比較，刺芒柄花素高劑量組、二甲雙胍組大鼠腎組織MDA、ROS水平降低(P<0.05，P<0.01)，GSH-Px、SOD活性升高(P<0.05，P<0.01)，而刺芒柄花素低劑量組大鼠上述指標無明顯變化(P>0.05)。

表3 刺芒柄花素對糖尿病腎病大鼠腎組織氧化指標的影響Tab.3 Effects of formononetin on renal tissue oxidation indices in rats with diabetic nephropathy n=15)

3.5 刺芒柄花素對糖尿病腎病大鼠腎組織Nrf2/HO-1表達的影響 如表4～5、圖3所示，與正常對照組比較，模型組大鼠Nrf2/HO-1通路受到抑制，腎組織Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，刺芒柄花素高劑量組、二甲雙胍組大鼠Nrf2/HO-1通路激活，腎組織Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表達升高(P<0.05)，而刺芒柄花素低劑量組大鼠Nrf2/HO-1通路無明顯變化(P>0.05)。

表4 刺芒柄花素對糖尿病腎病大鼠腎組織Nrf2、HO-1 mRNA表達的影響Tab.4 Effects of formononetin on the renal tissue mRNA expressions of Nrf2 and HO-1 in rats with diabetic nephropathy n=15)

表5 刺芒柄花素對糖尿病腎病大鼠腎組織Nrf2、HO-1蛋白表達的影響Tab.5 Effects of formononetin on the renal tissue protein expressions of Nrf2 and HO-1 in rats with diabetic nephropathy n=15)

圖3 刺芒柄花素對糖尿病腎病大鼠腎組織Nrf2、HO-1蛋白表達的影響Fig.3 Effects of formononetin on the renal tissue protein expressions of Nrf2 and HO-1 in rats with diabetic nephropathy

4 討論

糖尿病腎病是終末期腎功能衰竭的重要原因。糖尿病腎病患者的全因死亡率、心血管死亡率和腎功能衰竭的風險明顯增加[11]。據(jù)報道，糖尿病腎病患者24 h尿液MAER、血清Scr和BUN水平升高，導致疾病進展[12]。在本研究中，STZ誘導的糖尿病大鼠在病程進展4周后，出現(xiàn)24 h尿蛋白異常，尿液MAER、血清Scr和BUN水平均升高，光鏡下觀察到大鼠腎臟表現(xiàn)為腎小球肥大、增生以及系膜擴張等病理變化，成功建立糖尿病腎病大鼠模型。

糖尿病腎病的發(fā)病機制是多因素的，高血糖介導的多種途徑失調(diào)導致機體增強氧化應激強度，進一步誘導器官組織損傷。因此，氧化應激被認為是糖尿病腎病進展的一個中心介質(zhì)。糖尿病腎病患者早期腎組織MDA水平升高，總抗氧化能力降低，腎組織中總抗氧化能力和MDA水平與腎組織學評分有良好的線性相關(guān)性[13]。說明在糖尿病腎病早期階段，糖尿病腎病患者的抗氧化能力已經(jīng)下降。本研究結(jié)果表明，糖尿病4周后腎組織中MDA水平升高，SOD和GSH-Px活性降低。糖尿病腎病大鼠腎臟的抗氧化能力隨著腎損傷的嚴重程度而減弱。Nrf2/HO-1信號通路作為氧化應激防御系統(tǒng)中的關(guān)鍵途徑，在糖尿病腎病病程發(fā)展中具有兩面性。一方面，Nrf2缺乏癥減輕了糖尿病小鼠的高血壓和腎病[14]；另一方面，激活Nrf2可預防糖尿病性腎病[15]。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病大鼠腎臟Nrf2和HO-1表達降低。綜合分析，Nrf2具有兩面性可能是由于在糖尿病腎病早期，腎組織Nrf2/HO-1信號通路激活促進抗氧化酶生成，抵抗氧化應激，保護糖尿病腎病誘導的腎損傷。隨著病程的發(fā)展，在糖尿病腎病后期，腎損傷情況越來越嚴重，此時Nrf2/HO-1介導的抗氧化作用無法控制損傷的發(fā)展，腎組織內(nèi)氧化、抗氧化動態(tài)平衡破壞，氧化應激占主導地位，因此腎組織內(nèi)Nrf2/HO-1信號通路被抑制。

刺芒柄花素在多種與氧化應激相關(guān)的臨床病理模型中發(fā)揮抗氧化作用[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，刺芒柄花素能通過減輕病變腎臟腎盂積水，阻礙腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展保護腎間質(zhì)纖維化大鼠的腎功能[18]。研究發(fā)現(xiàn)[6]，刺芒柄花素在急性腎損傷大鼠中上調(diào)了腎組織Nrf2的表達，進而誘導HO-1的表達和SOD活性增加。但在糖尿病引起的慢性腎病中，刺芒柄花素還未有相關(guān)報道。本研究結(jié)果顯示，刺芒柄花素能有效降低糖尿病腎病大鼠血糖和血脂，提高腎組織抗氧化能力，減輕糖尿病腎病大鼠氧化應激引起的腎損傷。同時，刺芒柄花素還能激活糖尿病腎病大鼠腎組織Nrf2/HO-1信號通路，結(jié)合之前的研究，可以推測刺芒柄花素對糖尿病腎病大鼠腎組織氧化應激損傷的治療作用可能與Nrf2/HO-1信號通路的調(diào)控相關(guān)。

綜上所述，刺芒柄花素能減輕糖尿病腎病大鼠腎損傷，改善腎功能，降低血糖血脂，抑制腎組織氧化應激，其機制可能與激活Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)。