芙蓉凝膠對急性乳腺炎大鼠的抗炎作用及機制

萬 靜，陳曉蘭，楊曉梅，楊敬鴻，韓 偉，高 遠

(1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2.福建省南平市人民醫院，福建 南平 354200；3.畢節醫學高等專科學校，貴州 畢節 551700)

急性乳腺炎是乳腺的急性化膿性感染，好發于產后哺乳的婦女，尤以初產婦更為多見，往往發生在產后3～4周[1]。因乳房血管豐富，早期就可出現寒戰、高熱及脈搏加快等膿毒血癥表現。西醫主要通過抗生素等藥物治療和穿刺或引流等手術治療該疾病，預后較好。但對于哺乳期的婦女使用抗生素，其孩子會出現一些菌群失調、腹瀉等癥狀[2]，而手術治療會對乳腺外形造成不可修復的損傷。中醫以清熱解毒、消腫排膿為主[3-4]，臨床上用乳腺寧搽劑治療急性乳腺炎，效果顯著。其藥物組成有木芙蓉葉和穿心蓮。由于搽劑存在施藥不方便，藥液易于流淌的缺陷，課題組前期將其制備成芙蓉凝膠劑，具有使用方便、貼敷舒適、刺激性小、患者依存性高、載樣量大等優勢。本研究以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導急性乳腺炎大鼠為對象，通過觀察大鼠乳腺組織病理切片，檢測其乳腺組織中相關炎癥因子白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的水平和髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的活性,從炎癥因子和分子蛋白水平等方面探討芙蓉凝膠對LPS誘導急性乳腺炎大鼠的保護作用及可能機制，并借助信息熵理論綜合評價不同劑量芙蓉凝膠對上述指標的影響，以期為外用新劑型的研發和臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 SD大鼠，體質量250 g，購于長沙市天勤生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(湘)2014-0011。給予充足的水和鼠飼料，自由飲水攝食，適應性飼養1周后，雌雄鼠按2∶1的比例同籠飼養，當雌鼠有明顯孕相后，將雄鼠移出，待雌鼠自由產仔。

1.2 藥物與試劑 空白凝膠膏劑、芙蓉乳腺寧凝膠膏劑(自制，符合凝膠膏劑要求)；乳腺寧貼(批號201804092，桂林市威諾敦醫療器械有限公司)。脂多糖(批號044M4000V，美國Sigma公司)；蘇木素(批號180634)及IL-1β、IL-6、TNF-α酶聯免疫吸附測定法(ELISA)試劑盒(批號1218E18)均購自南京賽博生物技術有限公司；滅菌PBS溶液(pH 7.2～7.4，批號20180829，北京索萊寶科技有限公司)；MPO兔單克隆抗體[批號ab208670，艾博抗(上海)貿易有限公司]；山羊抗兔工作液(批號SP-9001)、正常山羊血清(批號ZLI-9021)、濃縮型DAB試劑盒(批號K135925C)均購自北京中衫金橋生物技術有限公司。水合氯醛(批號2015050501，成都市新科龍化工試劑廠)；75%乙醇(批號180826，貴州康泰利健消毒制品有限公司)；4%多聚甲醛(批號1804895，蘭杰柯科技有限公司)。

1.3 儀器 BCD-201STPA型冰箱(青島海爾股份有限公司)；Multlskan Mk3型酶標儀[賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司]；-80 ℃冰箱(青島海爾特種電器有限公司)；徠卡-2016型轉輪式切片機(德國Leica公司)；TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機、BMJ-Ⅲ型包埋機、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)；BA400Digital型數碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司)。

2 方法

2.1 造模 參考文獻[5]報道，選取分娩后5～7 d，乳頭管明顯膨大、完整性好的雌鼠，4%水合氯醛麻醉(0.75 mL/100 g)后固定在手術臺上，用剪刀將大鼠第4對乳腺周圍的毛小心剔除(不可剪破鼠皮)，面積7 cm2左右，并用醫用膠帶、鐵絲網、紗布固定大鼠腹部，使其松緊適度，不影響飲水攝食，連續4 d。第5天將大鼠麻醉，固定在手術臺上，用75%乙醇對第4對乳腺周圍消毒，用鑷子將該處乳頭輕輕調起，使其充分暴露，左手拿小鑷子輕輕夾起并固定，右手用剪刀小心剪掉乳頭管尖端1 mm左右，用100 μL鈍性微量進樣器往大鼠每側乳頭管緩慢灌注100 μL 1 mg/mL LPS，停留數秒后，將微量進樣器緩慢拔出，用棉簽輕揉乳腺周圍，使LPS均勻分布。

2.2 藥物制備 根據課題組前期均勻試驗優選出的最佳基質處方(NP700 0.100 0 g、高嶺土0.500 0 g、甘油 4.146 7 g、PVP 0.398 2 g、酒石酸0.004 0 g、甘羥鋁0.040 0 g，水4.000 0 g)，加入3%丙二醇促滲劑，制得空白凝膠膏劑[6]。課題組前期以君藥木芙蓉葉臨床劑量的8倍，即每天1.7 g/kg為有效劑量換算成小鼠總劑量[7-8]，用等比基線法設定木芙蓉、穿心蓮不同配比，進行鎮痛抗炎實驗[9]，確定兩者最佳配比為1∶1，分別以空白凝膠膏劑中載10%、1.25%的木芙蓉葉與穿心蓮純化物為高、低劑量組[6]。

2.3 分組與給藥 分組前1 h將幼鼠與母鼠分開，將雌鼠隨機分為空白組(0 g/kg)、假手術組(0 g/kg)、模型組(0 g/kg)、陽性組(1 g/kg)和芙蓉凝膠低(2 g生藥/kg)、高劑量組(16 g生藥/kg)，每組10只，空白組、假手術組、模型組均于大鼠第4對乳腺貼空白凝膠，陽性組貼乳腺寧貼，芙蓉凝膠組貼相應的藥物，每天1次，連續4 d，第5天模型組、給藥組大鼠按“2.1”項下方法處理，空白組不做任何處理，假手術組大鼠緩慢注入滅菌PBS溶液(100 μg/側)，造模后各組大鼠再給藥1次。

2.4 取材 造模24 h后大鼠脫頸處死，固定在手術臺上，75%乙醇擦拭第4對乳腺周圍，剪刀小心大鼠腹部(切勿剪破腹膜)，剝開皮膚以使乳腺充分暴露，剝離組織，左側用4%多聚甲醛固定，用于后期制作病理組織學切片和免疫組化切片；右側迅速轉移至-80 ℃冰箱保存，用于IL-1β、IL-6、TNF-α水平的檢測。

2.5 病理切片制備和HE染色 流水沖洗固定好的大鼠乳腺組織，梯度乙醇脫水，依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中直至呈透明狀態，石蠟包埋，切片，烘干，脫蠟，進行HE染色和封片，在顯微鏡下觀察病理組織變化。

2.6 MPO表達檢測 大鼠乳腺組織經脫水、透明、石蠟包埋、切片、烘干、脫蠟后，滴加山羊血清封閉液進行抗原修復并阻斷內源性過氧化物酶，加入MPO抗體，在4 ℃濕盒中孵育過夜，加入酶標二抗，室溫孵育20 min，DAB顯色液顯色，終止顯色后蘇木素復染，脫水后封片，鏡檢，采用數碼三目攝像顯微攝像系統對切片進行圖像采集，Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統檢測光密度(OD)和面積，計算每張圖像平均OD值，用以表述MPO表達。

2.7 TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測 將右側大鼠乳腺組織取出后，按1∶9 的比例加入PBS溶液，組織勻漿機勻漿后離心15 min，棄去上層乳白色脂肪部分，收集上清液，采用ELISA 試劑盒檢測組織上清液TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2.8 統計學分析

3 結果

3.1 大鼠乳腺組織病理組織學變化 空白組和假手術組大鼠乳腺小葉結構較為明顯，未見其他明顯病理變化；模型組大鼠乳腺組織病變嚴重，乳腺小葉結構較為明顯，腺泡數量較為正常，導管管腔內有大量中性粒細胞滲出；陽性組大鼠乳腺小葉結構較為明顯，導管及腺泡管腔內有少量中性粒細胞滲出，未見其他明顯病理變化；芙蓉凝膠低劑量組乳腺小葉結構較為明顯，導管管腔內有較多中性粒細胞滲出；芙蓉凝膠高劑量組大鼠乳腺小葉結構明顯，導管上皮細胞形態及腺泡數量較為正常，導管管腔內有少量中性粒細胞滲出，見圖1。與空白組比較，模型組大鼠炎癥反應及乳腺、導管等細胞損傷明顯增強；與模型組比較，陽性組、芙蓉凝膠高劑量組大鼠病變程度相對較輕，芙蓉凝膠低劑量組作用一般，提示陽性組、芙蓉凝膠高劑量組對急性乳腺炎模型大乳腺組織有較好改善作用。

圖1 大鼠乳腺組織病理圖(HE，×400)Fig.1 Histopathological images for mammary gland of rats in each group (HE，×400)

3.2 大鼠乳腺組織MPO表達 表1顯示，模型組大鼠乳腺組織MPO表達升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性組、芙蓉凝膠高劑量組大鼠乳腺組織MPO表達均降低(P<0.01)，芙蓉凝膠低劑量組無明顯變化(P>0.05)。

表1 各組大鼠乳腺組織MPO表達Tab.1 MPO expressions in mammary glands of rats in each group

3.3 大鼠乳腺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平 與空白組比較，模型組大鼠乳腺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性組、芙蓉凝膠高劑量組大鼠乳腺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平均降低(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠乳腺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平Tab.2 Levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in mammary glands of rats in each

3.4 藥效評價 對上述指標數據進行標準化處理，結果見表3，以其建立原始藥效指標矩陣(X)后轉換為概率矩陣(P)，見圖2，再根據概率矩陣計算第i個指標的熵值(Hi)，得Hi=[0.700 8,0.954 9,0.949 8,0.955 4]，計算各指標的權重系數(Wi)，為[0.681 4,0.102 7,0.114 3,0.101 6]，陽性組、芙蓉凝膠低劑量組、芙蓉凝膠高劑量組的M值分別為0.565、0.083、0.352，可知芙蓉凝膠高劑量組綜合影響較大，低劑量組影響較小。

表3 各組指標數據標準化處理結果Tab.3 Results of standardized processing of indicator data in each group

圖2 藥效指標矩陣(X)和概率矩陣(P)Fig.2 Pharmacodynamic index matrix (X)and probability matrix (P)

4 討論

LPS誘導的炎癥可使TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高，且TNF-α、IL-1β能夠調節嗜中性粒細胞的滲出，造成乳腺組織損傷，而MPO的表達和分布與嗜中性粒細胞的數量成正相關[14-15]，故本實驗選用TNF-α、IL-1β和IL-6指標評價芙蓉凝膠對LPS誘導的急性乳腺炎模型大鼠的影響。經芙蓉凝膠干預后，大鼠乳腺組織MPO的表達降低，高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平受到抑制，即對急性乳腺炎大鼠有較好的保護作用。

熵在信息論中，表示不確定性的量度[16]。熵權法以信息熵理論為依據，客觀地對各因素賦權，進行綜合評分，可為多指標研究數據分析提供依據[17]。在藥物效應評價試驗數據處理中，利用信息熵理論對多個效應評價指標進行客觀賦權，建立綜合評價度量指標，其綜合評分能直觀清晰反映不同劑量組藥物對多個效應指標的綜合影響，同時也避免了各指標數據間的相互影響，提升實驗研究的科學性與嚴謹性[18-19]。本研究借助信息熵理論，以炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平及MPO表達為藥效評價指標，最終建立綜合藥效評價度量指標，考察不同劑量芙蓉凝膠對大鼠MPO表達及炎癥因子水平的綜合影響。通過熵權法公式計算各指標的信息熵值，指標的信息熵越小，該指標提供的信息量越大，權重就越高，在綜合評價中所起作用越大[20]。熵權法計算得MPO信息熵最小，說明該因子在綜合評價中所起作用最大，在對LPS誘導的急性乳腺炎模型大鼠進行藥物效應評價時，選擇以MPO表達為評價指標具有一定可靠性。經芙蓉凝膠干預后，高劑量組MPO免疫組化檢測OD值降低(P<0.01)，即MPO的表達被抑制。熵權法綜合評分結果顯示，各藥效指標的綜合評分陽性組最高，芙蓉凝膠高劑量組次之，芙蓉凝膠低劑量最低，表明芙蓉凝膠對LPS誘導的急性乳腺炎模型大鼠有一定改善作用，其機制可能與抑制大鼠乳腺組織MPO表達有關。