2種滅菌方式對止嗽立效丸HPLC指紋圖譜和4種成分的影響

楊瑩瑩，張 璐，張文琴，劉瑛瑛，許信學，王曉燕*

[1.山西省藥品審評中心(山西省醫藥與生命科學研究院)，山西 太原 030006；2.山西華康藥業股份有限公司，山西 運城 044200]

止嗽立效丸由麻黃、苦杏仁、甘草、罌粟殼等7味中藥組成，具有止嗽、定喘、祛痰作用，收載于《衛生部藥品標準》中藥成方制劑第七冊，但其質量控制方法無含量測定及特征圖譜項；相關文獻也大多以鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、嗎啡等[1-5]為質控指標，未見指紋圖譜及多成分含量測定的報道。中藥制劑組成復雜，指紋圖譜能較全面地反映出其成分的種類及數量，從整體上對其質量進行評價[6-7]。

中藥常用滅菌方法有濕熱滅菌和輻照滅菌[8]，其中后者較常用的是60Co射線，具有操作方便、常溫常壓、效率高、耗時短等特點[9-10]。但輻照可能會引起部分成分發生變化[11-12]，從而影響藥物療效，因此關于其安全性尚有爭議[13-14]，《中藥輻照滅菌技術指導原則》規定，采用輻照技術對中藥進行滅菌時，必須說明它對產品質量的影響[15]。

本實驗建立了止嗽立效丸HPLC指紋圖譜和鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、鹽酸罌粟堿、甘草酸銨含量測定方法，比較60Co輻照滅菌、濕熱滅菌對指紋圖譜的影響及上述4種成分含量變化，以期客觀全面地反映不同滅菌方式對該制劑所含成分的影響，為輻照滅菌工藝在其他中藥制劑中的應用提供科學依據。

1 材料

Agilent 1200高效液相色譜儀，配置Agilent二極管陣列檢測器，購自美國Agilent公司；AB104N型電子天平，購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；KQ3200DE型數控超聲波清洗器，購自昆山市超聲儀器有限公司；UPHW-I-90T型優普系列超純水系統，購自成都超純科技有限公司。

鹽酸麻黃堿(批號171241-201508)、苦杏仁苷(批號110820-201607)、鹽酸罌粟堿(批號1214-9602)對照品，購自中國食品藥品檢定研究院；甘草酸銨(批號MUST-13093010)對照品，購自成都曼思特生物科技有限公司。乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為自制超純水。

未滅菌、60Co輻照滅菌、濕熱滅菌止嗽立效丸各5批，由山西華康藥業股份有限公司提供，具體信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件 安捷倫ZORBAX SB-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫(0～30 min，8%～24%乙腈；30～40 min，24%～50%乙腈；40～60 min，50%～64%乙腈；60～70 min，64%～96%乙腈；70～77 min，96%乙腈；77～80 min，96%～8%乙腈)；體積流量1.0 mL/min；檢測波長210 nm(0～24、42～77 min)、250 nm(24～42 min)；柱溫30 ℃；進樣量15 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、鹽酸罌粟堿、甘草酸銨對照品適量，甲醇溶解，制成分別含四者934、718、544、572 μg/mL的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取丸劑粉末0.50 g，置于具塞錐形瓶中，加入80%甲醇(含0.5%磷酸)10 mL，蓋塞，稱定質量，超聲提取30 min，冷卻，80%甲醇(含0.5%磷酸)補足減失的質量，濾過，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.3 HPLC指紋圖譜建立

2.3.1 方法學考察

2.3.1.1 精密度試驗 精密吸取同一份供試品溶液(批號Q201711131)15 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定5次，測得單峰面積大于總峰面積10%的共有峰相對保留時間RSD均小于1.0%，相對峰面積RSD均小于1.0%，相似度均大于0.99，表明儀器精密度良好。

2.3.1.2 重復性試驗 取同一批丸劑(批號Q201711131)，按“2.2.2”項下方法平行制備5份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得單峰面積大于總峰面積10%的共有峰相對保留時間RSD均小于1.0%，相對峰面積RSD均小于3.0%，相似度均大于0.99，表明該方法重復性良好。

2.3.1.3 穩定性試驗 取同一份供試品溶液(批號Q201711131)，于0、4、8、12、24、48 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得單峰面積大于總峰面積10%的共有峰相對保留時間RSD均小于1.0%，相對峰面積RSD均小于3.0%，相似度均大于0.98，表明溶液在48 h內穩定性良好。

2.3.2 圖譜生成 取15批丸劑，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取15 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，將檢測結果導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)》軟件，以S1為參照圖譜進行數據匹配，采用平均數法生成對照指紋圖譜(R)，結果共標定23個共有指紋峰(圖1)，共有峰相對保留時間RSD均小于1.0%，色譜圖見圖2。由此可知，與滅菌前比較，濕熱滅菌后峰21、22面積明顯減小，峰5幾乎消失，而60Co輻照滅菌后均無明顯變化。

圖1 對照指紋圖譜Fig.1 Reference fingerprint

注：S1～S3分別為滅菌前丸劑、60Co輻照滅菌后丸劑、濕熱滅菌后丸劑。圖2 滅菌前后HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms before and after sterilization

2.3.3 相似度評價 將各批樣品HPLC指紋圖譜(圖3)導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)》軟件進行數據匹配，采用平均數法生成對照指紋圖譜，建立共有模式，計算相似度，結果見表2。

圖3 15批樣品HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of fifteen batches of samples

表2 15批樣品相似度Tab.2 Similarities of fifteen batches of samples

由此可知，各批樣品相似度均在0.91以上，其中滅菌前、60Co輻照滅菌后相似度較高，而且比較接近，表明60Co輻照滅菌對指紋圖譜影響較小；濕熱滅菌相似度較低，表明在該滅菌方式下指紋圖譜變化較大。

2.3.4 共有峰峰面積比值比較 參考《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》[16]相關要求，經指紋圖譜峰面積數據匹配后計算單峰面積占總峰面積比例。結果，單峰面積占總峰面積比例在5%～10%之間的共有峰為峰3、5、11、22，在10%～20%之間的為峰6、21。

選擇穩定性好、分離效果理想的甘草酸銨(峰14)作為參照，計算滅菌前后共有指紋峰峰面積與參照物峰面積(A0)比值，以及滅菌前后共有峰峰面積比值的差值，公式為差值=[(Ax-A0)/A0]×100%，比較單峰面積占總峰面積比例≥5%共有峰的變化，結果見表3。

表3 滅菌前后共有峰峰面積比值比較Tab.3 Comparison of common peak area ratios before and after sterilization

由此可知，60Co輻照滅菌后，峰21、22面積明顯減小；濕熱滅菌后，除峰3、11外，其他共有峰峰面積比值的差值均大于±25%，尤其是峰5、21、22，表明濕熱滅菌對峰面積較大的共有峰(≥5%)影響更大。

2.4 成分含量測定

2.4.1 指標成分選擇 參考2020年版《中國藥典》一部、相關文獻和標準，預實驗考察了鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸銨、嗎啡、鹽酸罌粟堿等成分，與其指紋圖譜特征峰進行保留時間和紫外掃描圖譜的比對后，篩選出適合C18色譜柱分析和紫外檢測，而且對照品易獲得、色譜峰分離效果良好的4種成分作為指標，分別為鹽酸麻黃堿(峰3)、苦杏仁苷(峰6)、鹽酸罌粟堿(峰13)、甘草酸銨(峰14)，色譜圖見圖4。

3.鹽酸麻黃堿 6.苦杏仁苷 13.鹽酸罌粟堿 14.甘草酸銨3.ephedrine hydrochloride 6.amygdalin 13.papaverine hydrochloride 14.ammonium glycyrrhizinate圖4 各成分HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 線性關系考察 取“2.2.1”項下對照品溶液適量，80%甲醇稀釋成6個質量濃度，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表4，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表4 各成分線性關系Tab.4 Linear relationships of various constituents

2.4.3 精密度試驗 精密吸取同一份供試品溶液(批號Q201711131)15 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定5次，測得鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、鹽酸罌粟堿、甘草酸銨峰面積RSD分別為2.30%、0.78%、2.04%、0.58%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復性試驗 取同一批丸劑(批號Q201711131)，按“2.2.2”項下方法平行制備5份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、鹽酸罌粟堿、甘草酸銨含量RSD分別為0.79%、2.26%、1.85%、0.90%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 穩定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液(批號Q201711131)，于0、2、4、8、12、24、48 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、鹽酸罌粟堿、甘草酸銨峰面積RSD分別為2.43%、2.19%、2.66%、1.40%，表明溶液在48 h內穩定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 稱取各成分含量已知的丸劑(批號Q201711131)6份，每份約0.25 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入對照品溶液1 mL，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表5。

表5 各成分加樣回收率試驗結果(n=6)Tab.5 Results of recovery tests for various constituents (n=6)

2.4.7 樣品含量測定 取15批丸劑，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，外標法計算含量及其相對值[17]，平行3份，取平均值，再采用SPSS 22.0軟件對其進行單因素方差分析，結果見表6。由此可知，與滅菌前比較，濕熱滅菌后鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷含量降低(P<0.05)，而60Co輻照滅菌后各成分含量均無明顯變化(P>0.05)。

表6 各成分含量測定結果(mg/g)Tab.6 Results of content determination of various constituents (mg/g)

2.5 化學計量學研究

2.5.1 主成分分析 將各批樣品指紋圖譜相對峰面積導入SPSS 22.0軟件進行主成分分析，發現有2個貢獻較大的主成分，累積方差貢獻率為77.49%，即能代表原始數據77.49%的信息。以2個主成分的得分向量建立坐標，得到主成分得分圖(圖5)，可知濕熱滅菌后樣品均分布在FAC1坐標的負值區域，而滅菌前、60Co輻照滅菌后樣品均分布在FAC1坐標的正值區域，表明前者與其他樣品差異較大，而后兩者之間差異較小。

圖5 主成分得分散點圖Fig.5 Score scatter plot of principal components

2.5.2 聚類分析 將各批樣品相對峰面積導入SPSS 22.0軟件進行系統聚類分析，采用組間均連法，以歐式平方距離為分類依據，結果見圖6。由此可知，當閾值為25時，濕熱滅菌后樣品聚為一類，其他樣品聚為一類；當閾值減小后，滅菌前、60Co輻照滅菌后樣品又進一步分為2類，S4、S7、S10、S13聚為一類，S1與60Co輻照滅菌后樣品聚為一類，表明濕熱滅菌后樣品所含成分與其他樣品差異較大，而滅菌前、60Co輻照滅菌后樣品所含成分較一致，與“2.5.1”項下結果吻合。

圖6 聚類分析樹狀圖Fig.6 Dendrogram of clustering analysis

3 討論

3.1 色譜條件優化 本實驗發現，以水(含0.1%磷酸)-乙腈為流動相梯度洗脫時分離效果良好，基線平穩。通過全波長掃描和多波長檢測發現，在210 nm處色譜峰較多，基線平穩，信號強度高，故選擇其作為主要檢測波長；鹽酸罌粟堿、甘草酸銨在250 nm處有最大吸收，故采用切換波長模式將這兩者檢測波長設為250 nm。

3.2 提取條件優化 本實驗比較了水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯的提取效率，結果顯示水提取出極性成分較多，但弱極性者很少；乙醇提取20 min前色譜峰數量很少；乙酸乙酯只能提取出40 min以后的色譜峰；甲醇提取出的不同極性成分數量最多，響應信號高。

3.3 滅菌工藝比較 本實驗建立了止嗽立效丸HPLC指紋圖譜，指認了23個共有峰，同時對鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、鹽酸罌粟堿、甘草酸銨含量進行了測定。與濕熱滅菌比較，輻照滅菌對各成分含量的影響較小，更有利于最大程度保留藥材原有成分，能滿足相關研究需求，為該技術在其他中藥制劑中的應用提供科學依據。