鹽酸青藤堿在急性痛風大鼠體內的排泄動力學研究

鄭 爽，何忠梅，宗 穎，時 坤,2，陳維佳*，杜 銳,2*

(1.吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118；2.吉林農業大學，動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，吉林 長春 130118)

痛風是由于機體長期嘌呤代謝障礙，血尿酸水平增高，導致尿酸結晶沉積在關節及皮下組織，誘使炎癥細胞聚集發生吞噬反應，吞噬細胞破裂釋放出多種致炎致痛因子，表現為反復發作的關節紅、腫、熱、痛及痛風結石形成[1-4]，近年來發病率不斷上升，是最常見的關節炎形式之一[5-6]。目前，全世界對痛風的治療效果不明顯[7]，臨床常用的非甾體抗炎藥、秋水仙堿等具有肝、腎、胃腸道毒性等諸多不良反應[8]，故開發高效低毒的抗痛風中藥新藥勢在必行[9]。

青風藤為防己科植物青藤Sinomeniumacutum(Thunb.)Rehd.et Wils.、毛青藤Sinomeniumacutum(Thunb)Rehd.et Wils.var.cinereumRehd.et Wils.的干燥藤莖[10]，其主要成分青藤堿可通過抑制免疫、抗炎鎮痛、誘導細胞凋亡、保護軟骨等多種途徑來治療類風濕性關節炎[11]。為推動中藥現代化，中藥藥代動力學成為近年來興起的新領域[12]，對青藤堿的相關研究已有不少報道，但尚未涉及該成分在急性痛風大鼠體內的排泄動力學。因此，本實驗考察急性痛風大鼠尿液、糞便、膽汁中青藤堿隨時間的排泄變化規律，以期為臨床合理用藥提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；5810R型臺式高速離心機(美國貝克曼庫爾特公司)；BSA224S型電子分析天平(德國賽多利斯公司)；DW-H型超低溫冷凍存儲箱(中科美菱低溫科技有限責任公司)；ZH-B6型代謝籠(安徽正華生物儀器設備有限公司)；MX-F型漩渦混勻器(大龍興創實驗儀器有限公司)；LC-DCY-12G型干式氮吹儀(上海力辰邦西儀器科技有限公司)。

1.2 試劑與藥物 氧嗪酸鉀(純度≥99.7%，批號B22D9D78194)、黃嘌呤(純度≥98%，批號A11A9M58302)、尿酸鈉(純度≥98%，批號S16N8I46625)、烏來糖(純度≥98%，批號Z20J9Y64014)對照品(上海源葉生物有限公司)；鹽酸青藤堿對照品(純度≥98%，大連美侖生物技術有限公司，批號J0102A)；磷酸二氫鉀對照品(純度≥99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號J1811174)。三氯甲烷、異丙醇(國藥集團化學試劑有限公司)；乙腈為色譜純(美國 Fisher公司)；水為娃哈哈純凈水。

1.3 動物 雄性Wistar大鼠，體質量(200±20)g，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，動物生產許可證號SCXK(吉)-2015-0005。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 將大鼠分成正常組6只、模型組12只，適應性喂養1周。模型組大鼠連續7 d腹腔注射造模藥物(黃嘌呤與氧嗪酸鉀按1∶1比例配比的60 mg/mL混合液)0.5 mL/100 g，每天2次，而正常組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。第6天，2組大鼠右側關節腔注射30 mg/mL尿酸鈉100 μL[13]，軟尺測量大關節 2、4、6、8、10、12、24 h后的周長，計算關節腫脹率，公式為關節腫脹率=[(A-B)/B]×100%，其中A為注射尿酸鈉后不同時間點的關節周長，B為未注射尿酸鈉時的關節周長。

2.2 糞便、尿液排泄實驗 將12只模型組大鼠置于代謝籠中適應環境，實驗前12 h禁食不禁水，灌胃給予75 mg/kg鹽酸青藤堿，在0～2、2～4、4～6、6～8、8～10、10～12、12～24、24～36、36～48、48 ～72 h收集尿液和糞便，準確測量前者體積及后者質量。

2.3 膽汁排泄實驗 在糞便、尿液排泄實驗后1 d，12只模型組大鼠禁食12 h，不禁水，20%烏來糖麻醉后將背部固定在手術臺上，于上腹部作一小切口，分離膽管，插pe10聚乙烯管引流膽汁并收集，約1 h后灌胃給予75 mg/kg鹽酸青藤堿，于0～2、2～4、4～6、6～8、8～10、10～12、12～24、24～36、36～48 h收集膽汁并記錄體積，在-80 ℃下保存。實驗中期，大鼠股靜脈注射適量生理鹽水以補充失去的體液，膽汁定量稀釋后分析藥物排泄量，計算累積排泄量和累積排泄率。

2.4 樣品處理 取大鼠尿液0.1 mL，生理鹽水稀釋10倍后置于10 mL具塞試管中，加入氯仿-異丙醇混合液(4∶1)5 mL，超聲提取15 min后3 000 r/min離心5 min，取有機層，在60 ℃水浴中氮流吹干，殘渣用500 μL流動相溶解，取10 μL進樣分析。同法處理大鼠膽汁。將大鼠糞便烘干后研成粉末，稱取1 g，加入10 mL生理鹽水混勻，取1 mL，剩余處理方法同尿液。

2.5 色譜條件 ACE5 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；ZORBAX Eclipse XDC-C18保護柱(4.6 mm×12.5 mm，5 μm)；流動相乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀(10∶90)體積流量0.8 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長263 nm；進樣量10 μL。

3 結果

3.1 關節腫脹率 如圖1所示，模型組大鼠關節腫脹率在8～10 h達到最高，10 h后下降；正常組大鼠在24 h內未發生腫脹，即關節腫脹率為0。

圖1 不同時間點大鼠關節腫脹率Fig.1 Joint swelling rates of rats at different time points

3.2 方法學考察

3.2.1 線性關系考察 制備系列質量濃度鹽酸青藤堿溶液，加入定量空白生物樣品，配制8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80 μg/mL樣品溶液，在“2.5”項色譜條件下進樣測定。以鹽酸青藤堿峰面積為縱坐標(Y)，其質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，結果見表1，可知該成分在尿液、糞便、膽汁中均呈良好的線性關系。

表1 鹽酸青藤堿線性關系Tab.1 Linear relationships of sinomenine hydrochloride

3.2.2 專屬性試驗 取空白樣品，按“2.4”項下方法處理，在“2.5”項色譜條件下進樣測定，結果見圖2，可知該方法專屬性良好。

注：由于尿液、糞便、膽汁色譜圖相似，故限于篇幅，本實驗只提供尿液色譜圖。1.鹽酸青藤堿1.sinomenine hydrochloride圖2 鹽酸青藤堿HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of sinomenine hydrochloride

3.2.3 精密度試驗 制備鹽酸青藤堿低、中、高質量濃度(9、40、80 μg/mL)的質控樣品溶液各6份，在“2.5”項色譜條件下進樣測定，同一天內計算日內精密度，連續5 d計算日間精密度，結果見表2，可知該方法精密度良好。

表2 鹽酸青藤堿精密度試驗結果(n=6)Tab.2 Results of precision tests for sinomenine hydrochloride (n=6)

3.2.4 穩定性試驗 精密吸取對照品溶液適量，加入空白樣品制成低、中、高質量濃度(9、40、80 μg/mL)的質控樣品溶液各6份，按“2.4”項下方法處理，在“2.5”項色譜條件下進樣測定，分別測定室溫下24 h、反復凍融3次，-80 ℃下30 d的穩定性，結果見表3，可知該方法穩定性良好。

表3 鹽酸青藤堿穩定性試驗結果(n=6)Tab.3 Results of stability tests for sinomenine hydrochloride (n=6)

3.2.5 提取回收率試驗 制備鹽酸青藤堿低、中、高質量濃度(9、40、80 μg/mL)的質控樣品溶液各6份，在“2.5”項色譜條件下進樣測定，計算提取回收率，結果見表4。

表4 鹽酸青藤堿提取回收率試驗結果(n=6)Tab.4 Results of extraction recovery tests for sinomenine hydrochloride (n=6)

3.3 排泄動力學研究 正常組、模型組大鼠灌胃給予75 mg/kg鹽酸青藤堿后，取不同時間段尿液、糞便、膽汁，在“2.5”項色譜條件下進樣測定，計算排泄量，結果見表5，累積排泄量-時間曲線見圖3，藥動學參數見表6。

圖3 鹽酸青藤堿累積排泄量-時間曲線Fig.3 Accumulative excretion amount-time curves for sinomenine hydrochloride

表5 鹽酸青藤堿含量測定結果(n=12) Tab.5 Results of content determination of sinomenine hydrochloride (n=12)

表6 鹽酸青藤堿排泄動力學參數Tab.6 Excretion kinetic parameters for sinomenine hydrochloride n=12)

在尿液中，模型組大鼠于0～12 h檢測出原型藥物，累積排泄量占給藥量的18.65%，其中71.65%是在前6 h排泄的，12 h后排泄很少，低于HPLC法測定鹽酸青藤堿的檢測線；正常組大鼠只在0～6 h檢測出給藥量3.93%的原型藥物，與模型組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)；模型組T1/2長于正常組(P<0.05)。

在糞便中，模型組大鼠在0～6 h幾乎檢測不到鹽酸青藤堿，6～30 h檢測出給藥量11.82%的原型藥物；正常組大鼠在0～24 h檢測出給藥量6.13%的原型藥物，與模型組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)；模型組T1/2短于正常組(P<0.05)。

在膽汁中，2組均在0～6 h檢出原型藥物，其中模型組累積排泄量占給藥量的7.61%，而正常組占5.03%，2組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)；模型組T1/2短于正常組(P<0.05)。

4 討論與結論

本實驗采用腹腔注射黃嘌呤和氧嗪酸鉀的方法促使大鼠體內嘌呤代謝紊亂，從而使血尿酸水平升高，獲得更接近人體發病機制的急性痛風模型，結果發現灌胃給藥后，少部分鹽酸青藤堿以原型藥通過糞便、尿液、膽汁排泄，而大部分在大鼠體內轉化為其他形式。大鼠灌胃給予鹽酸青藤堿后，模型組、正常組分別在12、6 h內的尿液中檢出該成分，說明其尿排泄迅速，在腎臟不易蓄積；模型組鹽酸青藤堿原型藥物排泄量約為非模型組的6倍，推測可能是由于黃嘌呤、氧嗪酸鉀腹腔注射引起大鼠腎損傷，影響鹽酸青藤堿在體內的代謝轉化。

研究表明，健康人群、痛風患者糞便上清液的代謝圖譜存在明顯差異，腸道菌群紊亂與痛風發病之間存在密切關系[14]。本實驗發現，模型組大鼠糞便排泄量比正常組鹽酸青藤堿排泄多，鹽酸青藤堿在糞便中法人排泄速率也低于在尿液、膽汁中，推測腸道菌群異?？赡苁果}酸青藤堿在急性痛風大鼠體內的代謝轉化過程受阻；鹽酸青藤堿經膽汁排泄量較少，即不是主要排泄途徑，并且模型組、正常組膽汁排泄量差異較小，提示急性痛風對該成分膽汁排泄無明顯影響。

綜上所述，本實驗探討了鹽酸青藤堿在急性痛風大鼠體內的排泄特征，可為相關臨床治療和合理用藥提供參考。