雙特異性磷酸酶在腎臟疾病中的研究進(jìn)展

杜宇 章波 趙景宏

陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，重慶 400037

蛋白質(zhì)磷酸化是真核生物蛋白翻譯后修飾的重要手段之一，可調(diào)節(jié)蛋白活性，其廣泛地參與了機(jī)體內(nèi)各種生理活動(dòng)及病理過程。通過特異性的蛋白激酶以及蛋白磷酸酶對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化水平的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，使機(jī)體內(nèi)環(huán)境趨于穩(wěn)定。在真核生物中，根據(jù)磷酸化作用位點(diǎn)的不同，蛋白磷酸酶可分為酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)以及絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶。既往的研究多集中于蛋白酪氨酸激酶，然而近些年，隨著對(duì)PTPs超家族及其成員的深入研究使得可逆磷酸化在細(xì)胞內(nèi)的嚴(yán)格調(diào)控有了進(jìn)一步的認(rèn)知，為一些疾病的發(fā)生發(fā)展及防治策略提供了新的思路。

一、雙特異性磷酸酶的分類及特性

DUSPs是PTPs超家族中的一員，因其具有使酪氨酸殘基和絲氨酸/蘇氨酸殘基脫磷酸的雙重作用而備受關(guān)注。近年來，人類的DUSPs被歸屬于PTPs擴(kuò)展家族中cysteine-basedPTPs中的 Ⅰ 型 Ⅱ 亞型，即雙特異性VH1樣PTPs，其催化域包含有共同的HCxxGxxR位點(diǎn)，共由64個(gè)成員組成[1]。該亞型家族包括雙特異性MAPK磷酸酶(MKPs，11個(gè))，非典型DUSPs(atypical DUSPs，20個(gè))，絲切蛋白磷酸酶(Slingshots，3個(gè))，肝再生磷酸酶(PRL，3個(gè))，CDC14s(4個(gè))，磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN-like phosphatases，8個(gè))以及肌管素磷酸酶亞家族(MTMs，15個(gè))[1]。MKPs以及大部分非典型DUSPs均表現(xiàn)出對(duì)磷酸化的酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸特定的磷酸酶活性，因此被視為狹義上的DUSPs家族成員。

DUSPs之所以歸屬于PTPs家族，是因其PTPs活性較絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性高40～500倍，且酶活性結(jié)構(gòu)域具有同PTPs相似的結(jié)構(gòu)特征[2]。但DUSPs催化結(jié)構(gòu)域上催化位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)深度明顯淺于經(jīng)典PTPs，這使得DUSPs更易識(shí)別及接納包括酪氨酸、絲氨酸以及蘇氨酸在內(nèi)的多個(gè)氨基酸殘基所連接的磷酸基團(tuán)[3]。

1.MAPK磷酸酶 MAPK是細(xì)胞信號(hào)通路的重要組成部分，MAPK的異常調(diào)控與多種疾病有關(guān)。MAPK家族由細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，c-JNK)以及p38在內(nèi)的經(jīng)典成員組成[4]。迄今為止，由于MAPK抑制劑在疾病治療中療效的不確定性或存在一定的不良反應(yīng)，尚無相關(guān)藥物進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗(yàn)[5-6]。而對(duì)MAPK抑制劑的研究表明，針對(duì)其上游信號(hào)分子為靶點(diǎn)的治療可能比下游更為有效[6-8]。MKPs可通過對(duì)MAPK激酶結(jié)構(gòu)域中活化環(huán)T-X-Y位點(diǎn)上的蘇氨酸和/或酪氨酸去磷酸化，使MAPK失活從而拮抗細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[9]。MKPs的N端MAPK結(jié)合域(MAPK-binding domain，MKB)含有酶相互作用結(jié)構(gòu)域(kinase-interaction motif，KIM)，可與MAPK相作用介導(dǎo)酶-底物的特異性結(jié)合，使有活性的MAPK去磷酸化失活，也可使無活性的MAPK失去對(duì)外界刺激的反應(yīng)[10-11]。值得注意的是，典型DUSPs中的DUSP2(PAC1)、DUSP5和DUSP8同樣包含KIM卻并未命名為MKPs；另有非典型DUSP14(MKP6)和DUSP26(MKP8)雖無KIM，但仍可以使MAPK去磷酸化失活[12]。

根據(jù)功能結(jié)構(gòu)域、序列同源性以及亞細(xì)胞定位的不同，MKPs又可分為以下三類：(1)定位于細(xì)胞核的DUSPs，包括DUSP1(MKP1)、DUSP2(PAC1)、DUSP4(MKP2)和DUSP5(HVH3)，可作用于ERK1/2、p38和JNK蛋白，使其去磷酸化而抑制MAPK所介導(dǎo)的細(xì)胞生物活動(dòng)；(2)定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的DUSPs，包括DUSP6(MKP-3)、DUSP7和DUSP9(MKP4)，它們可以特異性的結(jié)合并去磷酸化MAPK家族中的ERK1/2蛋白；(3)可同時(shí)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的DUSPs，包括DUSP8(M3/6)、DUSP10(MKP5)、DUSP14(MKP6)和DUSP16(MKP7)，對(duì)JNK和p38具有更高的特異性[9，13-14]。MKPs對(duì)MAPK家族不同成員的特異性選擇可能與其所在的細(xì)胞類型或MKPs同MAPK相互結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)[9]。

2.非典型DUSPs 在20個(gè)非典型DUSPs的成員中包含有15個(gè)小型非典型DUSPs以及5個(gè)其他非典型DUSPs[1]。非典型DUSPs缺少類似MKPs N端所特有的MKB結(jié)構(gòu)域，因此其去磷酸化作用的底物仍不確定。其中DUSP14(MKP6)和DUSP26(MKP8)尚可與MAPK家族成員相互作用并調(diào)節(jié)MAPK活性。然而，非典型DUSPs更多見于對(duì)其他磷酸化蛋白底物的調(diào)節(jié)，它們甚至可作用于RNA或脂類等非蛋白類底物，進(jìn)而發(fā)揮去磷酸化作用。因此，非典型DUSPs具有更為廣泛的底物特異性，并且在生理功能上具有更多的可能性。

二、雙特異性磷酸酶與腎臟疾病

DUSPs在腎臟病領(lǐng)域中的研究相對(duì)較少，目前已有的研究多集中于糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)，亦有少量研究在其他常見腎臟疾病。

1.糖尿病腎病 DN是糖尿病的微血管并發(fā)癥。高糖、糖基化產(chǎn)物、腎內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞因子等多種因素均可導(dǎo)致DN中MAPK家族的活化。而MAPK信號(hào)通路的激活，尤其是p38和JNK信號(hào)途徑與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且相關(guān)研究已多有報(bào)道。例如對(duì)糖尿病動(dòng)物模型以及2型糖尿病患者的腎臟組織學(xué)分析顯示腎小球中p38處于長期激活狀態(tài)[15-17]，在血壓正常的糖尿病大鼠體內(nèi)，抑制p38的活性可減少蛋白尿和纖維粘連蛋白的產(chǎn)生[18]。Gene 33/Mig-6選擇性激活JNK在糖尿病發(fā)病早期及持續(xù)進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[19]。在DN中，尚未完全了解導(dǎo)致MAPK激活的確切機(jī)制。然而，鑒于DUSPs是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制MAPK的主要調(diào)節(jié)機(jī)制之一[20]，因此，近來一些研究致力于證實(shí)DUSPs家族參與了MAPK所介導(dǎo)的DN的發(fā)病機(jī)制。

大量證據(jù)表明，足細(xì)胞損傷在腎小球?yàn)V過屏障損傷以及DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[21-22]。亦有臨床研究報(bào)道，足細(xì)胞數(shù)量和密度的減少是DN持續(xù)進(jìn)展強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一[23]。近來有研究報(bào)道DUSP4和DUSP26參與了足細(xì)胞損傷致DN的發(fā)病機(jī)制。DUSP4(MKP2)是雙特異性MAPK磷酸酶，NLS1和NLS2是其定位于細(xì)胞核中的核定位序列[24]。DUSP4可因生長因子、細(xì)胞應(yīng)激、紫外線和LPS等誘導(dǎo)產(chǎn)生，并使JNK、p38和ERK去磷酸化失活[25-29]。其中Benoit Denhez等[30]的研究證實(shí)了高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞以及糖尿病小鼠和患者腎組織中DUSP4表達(dá)下降。在糖尿病小鼠中，DUSP4表達(dá)喪失導(dǎo)致p38和JNK的持續(xù)活化、氧化劑產(chǎn)生和細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致腎小球損傷、足細(xì)胞足突消失、功能障礙。對(duì)糖尿病患者腎皮質(zhì)中DUSP4的表達(dá)分析同樣證實(shí)，DUSP4 mRNA表達(dá)降低與患者eGFR下降相關(guān)[<60 mL·min-1·(1.73 m2)-1]。因此，阻止DN中DUSP4表達(dá)下降可能是延緩DN進(jìn)展的新靶點(diǎn)[30]。DUSP26(MKP8)是分子量約24 kDa的非典型DUSPs，同樣具有使MAPK失活的作用。據(jù)報(bào)道，DUSP26可以抑制p38磷酸化，從而阻斷p38介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的凋亡[31]。而抑制DUSP26的表達(dá)可以促進(jìn)MAPKs(p38/JNK)的活化，從而加速脂肪肝的進(jìn)展[32]。Huang等[33]的研究發(fā)現(xiàn)DN患者腎臟中DUSP26表達(dá)增加。采用DUSP26基因敲除小鼠(DUSP26-/-)進(jìn)一步觀察到腎損傷、腎小球硬化，Nephrin表達(dá)降低以及腎小球基底膜增厚。此外，在DUSP26-/-小鼠中，通過促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表達(dá)，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DN腎小球纖維化明顯加重；而減少活性氧的產(chǎn)生可消除DUSP26-/-小鼠中TGF-β1表達(dá)的增加和MAPKs的活化，從而保護(hù)足細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的損傷[33]。以上研究表明，DUSPs通過選擇性抑制MAPK家族成員可能是參與介導(dǎo)足細(xì)胞損傷在DN發(fā)病機(jī)制中的重要途徑之一。

DUSP1(MKP1)是DUSPs家族首個(gè)被鑒定且研究最為廣泛的成員，可在多種組織細(xì)胞中表達(dá)并參與細(xì)胞死亡、癌癥、炎癥以及代謝性疾病等多種生物學(xué)事件。體內(nèi)、外研究表明，DUSP1以細(xì)胞類型依賴的方式可使JNK、p38和ERK脫磷酸化，與JNK和p38的結(jié)合較ERK具有更強(qiáng)的親和力[34]。在DN中腎臟固有細(xì)胞存在線粒體自噬功能異常以及能量代謝、生物合成、動(dòng)力學(xué)紊亂，表明線粒體功能損傷亦與DN發(fā)病及進(jìn)展有關(guān)[35-37]。近來有多個(gè)研究報(bào)道了MKP1與線粒體功能失調(diào)在糖尿病腎損害中的詳細(xì)作用。Zhang等[38]的研究表明在高糖應(yīng)激下，MKP1缺乏可促進(jìn)線粒體損傷和腎小球系膜細(xì)胞凋亡。在此過程中，線粒體片段化是傳遞和放大損傷信號(hào)以啟動(dòng)腎小球系膜細(xì)胞死亡必不可少的元素。而過表達(dá)MKP1可通過抑制JNK-鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶Ⅱ-線粒體分裂蛋白1信號(hào)途徑(JNK-CaMKⅡ-Fis1 pathway)和穩(wěn)定線粒體功能逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象[38]。同樣Sheng等[39]的研究重點(diǎn)介紹了DUSP1通過調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)來控制DN進(jìn)展的新途徑，即高糖誘導(dǎo)的DUSP1下調(diào)可激活JNK途徑，開啟線粒體裂變因子介導(dǎo)的線粒體裂變，該線粒體動(dòng)力學(xué)的不平衡進(jìn)一步加重了腎損害。這些研究表明，DUSP1在線粒體功能損傷致DN發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制中具有重要意義，以DUSP1-JNK信號(hào)途徑為核心的調(diào)控作用參與了這一過程，這為DN的治療開辟了新的思路。

2.高血壓腎病 腎臟既是高血壓損害的重要靶器官之一，又是導(dǎo)致高血壓的重要組織器官。DUSP1除在DN中發(fā)揮作用外，Chen等[40]對(duì)高血壓腎病基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析后同樣發(fā)現(xiàn)DUSP1表達(dá)下降，這在血管緊張素Ⅱ處理HK-2的細(xì)胞模型中也得到證實(shí)。DUSP5(hVH3)是一種核MKP，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)可由熱休克蛋白和生長因子所誘導(dǎo)，能同MAPK家族中的ERK特異性結(jié)合使其發(fā)生核轉(zhuǎn)位和失活[41]。DUSP5可被泛素化蛋白酶體降解，其降解會(huì)增強(qiáng)ERK信號(hào)傳導(dǎo)的幅度和持續(xù)時(shí)間[42]。相反，ERK可通過抑制DUSP5泛素化來維持DUSP5穩(wěn)定，該調(diào)節(jié)獨(dú)立于ERK激酶活性，但取決于ERK-DUSP5的相互作用[43]。目前尚未廣泛研究DUSP5對(duì)腎臟疾病可能帶來的影響。Zhang等[44]的研究證實(shí)DUSP5-/-大鼠引起PKCα和ERK1/2激活，進(jìn)而增強(qiáng)腎入球小動(dòng)脈和小葉間動(dòng)脈的肌反應(yīng)性。在醋酸去氧皮質(zhì)酮-鹽(DOCA-salt)高血壓大鼠模型中，敲除DUSP5可改善腎血流量對(duì)高血壓的自動(dòng)調(diào)節(jié)能力，減少蛋白尿。DUSP5-/-大鼠還可降低腎臟中MCP-1的表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞浸潤，并下調(diào)TGF-β1、MMP2和MMP9的表達(dá)，抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和腎纖維化。因此，抑制DUSP5可通過增強(qiáng)腎血管反應(yīng)性和加強(qiáng)腎血流自動(dòng)調(diào)節(jié)能力來預(yù)防高血壓腎損傷的發(fā)生[44]。值得一提的是，MKPs是多數(shù)腎臟疾病進(jìn)程中負(fù)向調(diào)控的重要分子。而在Zhang等[44]的研究中，DUSP5基因敲除大鼠在高血壓腎病中顯示了一定的保護(hù)作用。這可能歸咎于不同的MKPs亞型選擇作用于MAPK家族不同成員，其在某一特定的疾病模型中所具有的作用表現(xiàn)。在血管平滑肌細(xì)胞中，ERK1/2和PKC磷酸化可通過激活瞬時(shí)受體電位、上調(diào)細(xì)胞內(nèi)鈣水平、活化鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白等方式來加強(qiáng)血管反應(yīng)性，改善腎血流量對(duì)高血壓的自動(dòng)調(diào)節(jié)能力，從而減少炎性細(xì)胞因子和促纖維化介質(zhì)的產(chǎn)生[44]。因而Zhang等[44]的研究中DUSP5顯現(xiàn)了不同于多數(shù)MKPs亞型的效應(yīng)表現(xiàn)，這與ERK蛋白在高血壓腎病中的功能不可分割。而更多的DUSPs家族成員在高血壓腎病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

3.急性腎損傷 急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是多種病因引起的腎功急劇下降的危急重癥。其中腎缺血再灌注損傷是引起AKI的重要原因之一，然而迄今為止缺血再灌注損傷所涉及的病理生理機(jī)制尚未完全闡明。Chang等[45]利用DNA芯片技術(shù)分析了缺血再灌注損傷大鼠模型中腎臟的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注損傷組與MAPK途徑相關(guān)的DUSP1存在顯著上調(diào)，且通過定量聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)一步確認(rèn)DUSP1 mRNA表達(dá)水平與其一致[45]。因此，對(duì)于新的DUSPs關(guān)鍵分子及其作用機(jī)制的進(jìn)一步探索對(duì)AKI的預(yù)防及治療具有積極的意義。

4.慢性腎臟病 慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)發(fā)病率逐年遞增，腎小球硬化以及腎間質(zhì)纖維化是CKD進(jìn)展至終末期腎病的共同病理表現(xiàn)，早期干預(yù)可明顯延緩CKD進(jìn)程，降低并發(fā)癥發(fā)生率以及病死率。因此，對(duì)其預(yù)測(cè)因子及發(fā)病機(jī)制的深入研究具有重要的臨床價(jià)值。Li等[46]的研究發(fā)現(xiàn)在單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠模型的腎小管上皮細(xì)胞以及TGF-β1誘導(dǎo)的NMT-52E細(xì)胞的EMT過程中MKP2(DUSP4)的表達(dá)上調(diào)。MKP2可抑制JNK信號(hào)傳導(dǎo)并部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1所誘導(dǎo)的EMT；相反，抑制MKP2可促進(jìn)上皮鈣黏素、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)以及纖維粘連蛋白的分泌，這一過程可被JNK抑制劑所拮抗[46]。以上這一研究是基于DUSP4所參與的腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化致腎纖維化發(fā)生發(fā)展這一經(jīng)典機(jī)制展開。然而，細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、TGF-β1/Smad信號(hào)途徑等多種重要的腎臟纖維化病理過程中，又有哪些DUSPs家族成員參與其中亟待更多的研究探討。

三、小結(jié)

DUSPs作為一種酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸雙特異性磷酸酶而備受矚目。既往DUSPs研究多集中在炎癥及腫瘤領(lǐng)域，深入了解DUSPs家族中各成員在腎臟疾病中的作用及調(diào)控機(jī)制，將有助于為腎臟病的防治提供新思路。因此，DUSPs家族在腎臟領(lǐng)域?qū)⑹且粋€(gè)值得重視及深入探索的新靶點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突