巴斯德畢赤酵母多拷貝整合表達組裝禽流感病毒樣顆粒

薛 倩，馬文戈，沙依蘭·卡依扎，汪 萍，韓 濤，苗書魁，夏 俊，陸桂麗

(1．新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830000；2. 新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學院動物臨床醫(yī)學研究中心，烏魯木齊 830011)

0 引 言

【研究意義】禽流感是由A型流感病毒(avian influenza virus, AIV)引起雞、鴨、鵝、火雞、鴿、野生禽類等的急性、熱性、高度接觸性傳染病，按照病原類型分類，禽流感可分為高、低和非致病性三類。其中高致病性禽流感H5N1亞型高發(fā)病率和死亡率[1-3]。接種疫苗是預防禽流感的有效方法，目前商用疫苗大多數(shù)為全病毒滅活疫苗。AIV病毒樣顆粒疫苗(virus-like particles, VLPs)具有接近滅活全病毒的免疫效力，且更加安全，生產(chǎn)過程中不需要使用活病毒，不存在生物安全問題，有望替代全病毒滅活疫苗[4]。【前人研究進展】流感病毒VLPs組裝時，結(jié)構(gòu)蛋白聚合酶PB1(Polymerase Basic 1)、聚合酶PB2(Polymerase Basic 2)、聚合酶PA(polymerase Acidic)、核蛋白(Nucleoprotein, NP)、血凝素蛋白(Hemagglutinin, HA)、神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase, NA)和基質(zhì)蛋白2(Matrix Proteins 2, M2)不是必需成分，其顆粒的基本結(jié)構(gòu)為基質(zhì)蛋白1(Matrix Proteins 1, M1)。M1蛋白單獨可組裝為類似天然病毒顆粒的VLPs[5]。在哺乳動物細胞、草地貪夜蛾sf9細胞中共表達M1蛋白、HA蛋白和/或NA蛋白，后者可鑲嵌在M1顆粒結(jié)構(gòu)表面，形成有刺突樣結(jié)構(gòu)的流感病毒VLPs。大部分流感病毒VLPs表達組裝，多采用了哺乳動物和sf9細胞系統(tǒng)，生產(chǎn)過程控制難度大，培養(yǎng)成本高[6-8]，但真菌表達的HA免疫原性稍低[9]。【本研究切入點】巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)成功表達了大量外源蛋白，但以載體pPIC9K為基礎(chǔ)的表達系統(tǒng)，多數(shù)情況下是低拷貝外源基因整合，對外源蛋白的表達量較低[10]。【擬解決的關(guān)鍵問題】對pPIC9K載體進行多拷貝整合改造，插入18S rDNA部分序列作為重組同源臂，構(gòu)建多拷貝整合表達禽流感HA、M和NA基因的重組酵母，誘導表達、組裝AIV VLPs，為禽流感基因工程疫苗研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑

ExTaq聚合酶為 Promega 公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶EcoRV、BglⅡ、BspMⅡ 、SnaBⅠ、NotⅠ、XbaⅠ、Bsp1407Ⅰ、XhoⅠ和EcoRⅠ，1kb DNA Marker、T4DNA 連接酶，為Thermo公司產(chǎn)品；RT-PCR一步法試劑盒、pMD 19-T vector為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)核酸抽提試劑、質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、核酸膠回收試劑盒、蝸牛酶-蛋白酶K-SDS法酵母基因組抽提試劑盒、酵母蛋白酶抑制劑、改良Bradford法蛋白含量測定試劑盒、YPD培養(yǎng)基為上海生工生物技術(shù)公司產(chǎn)品；新生牛血清、DMEM 培養(yǎng)基，為 Hyclone 公司產(chǎn)品。病毒基因組RNA抽提試劑盒、酵母培養(yǎng)基BMGY、BMMY、YNB，為 Invitrogen 公司產(chǎn)品；遺傳霉素G418、葉酸，為Sigma公司產(chǎn)品；佐劑 MONTANIDEISA 206 VG，為SEPPIC公司產(chǎn)品。

1.1.2 病毒基因組、細胞、抗體和質(zhì)粒

病毒基因組RNA，Trizol抽提自新疆伊犁野生禽類糞便樣品(RNA / XJ / YL / 2018)，-80℃凍存。商品禽流感H5N1亞型滅活疫苗及免疫雞血清，由新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所保存； HRP 標記兔抗雞 IgY，為 Sigma 公司(Birmingham, AL, USA)產(chǎn)品。巴斯德畢赤酵母GS115株及載體 pPIC9K，購自 Invitrogen 公司。

1.1.3 主要設(shè)備

電轉(zhuǎn)杯 Electroporation Cuvette 1mm、電轉(zhuǎn)化儀 Eporator，是 Eppendorf 公司產(chǎn)品；細胞高壓破碎儀，型號 TS-0.75 KW，為 Constant System LTD 產(chǎn)品；電泳儀PowerPac Universal，電轉(zhuǎn)儀 Mini-PROTEAN Tetra System，為 Bio-RAD 公司產(chǎn)品；50mL Mini bioreactor， 為Corning公司產(chǎn)品；PCR 儀 Tprofessional TRID Therocycler，為 Biometra 公司產(chǎn)品；超速離心機 Beckman Coulter Optima MAX-XP Ultracentrifuge。

1.2 方 法

1.2.1 基因序列獲取

根據(jù)禽流感病毒參考毒株 A/LGD/1/9/(GenBank: JX486550) 基因組序列，設(shè)計引物對，委托上海生工生物工程公司合成。以RNA/ XJ / YL / 2018為模板，RT-PCR方法擴增禽流感病毒結(jié)構(gòu)蛋白HA、M和NA基因。反應條件如下：55℃，30 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，30循環(huán)；72℃ 10 min。電泳膠回收PCR產(chǎn)物，連接于 pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細胞，在氨芐青霉素抗性 LB 平板篩選陽性菌落，抽提質(zhì)粒，XhoⅠ/EcoRⅠ/KpnⅠ 分別消化pMD19T-HA/M/NA質(zhì)粒鑒定。陽性質(zhì)粒委托上海生工生物工程公司測序。表1

1.2.2 多拷貝整合載體構(gòu)建

設(shè)計上游引物，5’ -TGT ACA AA GGC AGG GAC GTA ATC- 3’，下游引物：5’ -TCT AGA GCT AAT ACT TGA TCA GCC- 3’，下劃線標注的序列為XbaⅠ 和Bsp1407Ⅰ限制酶位點，委托上海生工生物工程公司合成。以巴斯德畢赤酵母 GS115 株18S rDNA序列(GenBank: FN392325.1)為模板，PCR擴增1 292 bp 的部分序列，膠回收產(chǎn)物，并連接于 pMD19-T 載體，BspMⅡ 酶切鑒定質(zhì)粒；陽性質(zhì)粒委托上海生工生物工程公司測序。XbaⅠ和Bsp1407Ⅰ共用Tango buffer消化陽性pMD19-T-1 292 bp質(zhì)粒和載體 pPIC9K，分別電泳膠回收 1 292 bp 和 7.01 Kbp，T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細胞，在氨芐青霉素LB 平板篩選陽性菌落，抽提質(zhì)粒，NotⅠ酶切鑒定，陽性質(zhì)粒委托上海生工生物工程有限公司測序，序列正確者命名為 p8K。PCR 反應體系組成為：10×ExTaqBuffer 5 μL；2.5 mmol / L dNTP (10 mmol / L) 2.5 μL；DNA 模板 1.0 μL；上、下游引物(10 pmol / μL)各2.5 μL；ExTaqDNA 聚合酶 1.0 μL；去離子水 35.5 μL。PCR擴增反應條件為：94℃ 2 min；94℃ 30 s，50℃ 15 s，72℃ 90 s，30 循環(huán)；72℃ 10 min。

取測序正確的pMD19-T-HA/M/NA質(zhì)粒，用EcoRⅤ/NotⅠ分別消化pMD19-T-HA，用SnaBⅠ/NotⅠ分別消化pMD19-T-M和pMD19-T-NA，與用SnaBⅠ/NotⅠ分別消化的 p8K連接，轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細胞，在氨芐青霉素LB平板篩選、擴增陽性菌落，抽提質(zhì)粒，NotⅠ 消化鑒定，陽性質(zhì)粒委托上海生工生物工程有限公司測序，序列正確的質(zhì)粒命名為 p8K-HA/M/NA。

1.2.3 酵母重組及篩選

分別擴大培養(yǎng)、抽提p8K-HA/M/NA質(zhì)粒，經(jīng)BspMⅡ 消化，酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)核酸抽提法回收線性化質(zhì)粒，測定核酸濃度，將其終濃度定量為1 μg/μL。然后，按照p8K-HA∶p8K-M∶p8K-NA = 4∶10∶1(v/v)的比例混合上述3個質(zhì)粒[11]。按照 pPIC9K A Pichia Vector for Multicopy Integration and Secreted Expression (Catalog no. V175-20) 操作手冊方法電轉(zhuǎn)移。同時以 p8K作為對照。電轉(zhuǎn)移產(chǎn)物置于室溫1 h，再加入 1.25 mL BMGY，在 25℃、250 r/min 條件下培養(yǎng) 24 h。分別取培養(yǎng)物 100 μL，涂布 1、2、3 mg/mL G418 YPD 平板，25℃ 培養(yǎng) 3～5 d。挑取單菌落，分別接種 BMGY培養(yǎng)基。25℃、250 r/min，培養(yǎng) 2～3 d，分別取 500 μL，蝸牛酶-蛋白酶K-SDS 法抽提酵母基因組，作為 PCR 的模板。陽性重組菌株鑒定用引物參考表1，反應程序為：94℃，2 min；94℃ 30 s，55℃ 15 s，72℃ 90 s，30 循環(huán)；72℃ 10 min。陽性重組菌株應擴增出HA、M和NA條帶，陰性菌株無相應條帶。陽性重組菌命名為 rAI-x(x代表菌株順序編號)。表1

1.2.4 誘導表達與蛋白提取

經(jīng) PCR 方法鑒定為陽性的重組菌株，接種 BMGY培養(yǎng)，25℃，250 r/min條件下培養(yǎng) 3 d。10 mL菌液離心收集細胞，加入BMMY培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，25℃，250 r/min 條件下培養(yǎng)5 d，期間分別于第2 d、4 d補充1.0%甲醇。收集菌體，PBS 洗滌2次，加入 0.1% 真菌蛋白酶抑制劑，高速勻漿法破碎酵母細胞，高壓破碎儀TS-0.75 KW, 2.7 Kbar，3 min，4℃循環(huán)冷凝水制冷；重復1次。再反復凍融3次。4℃，5,000 r/min 離心1 min，將上清與細胞碎片分離。細胞碎片用10倍體積PBS溶解，-20℃凍存?zhèn)溆谩Ｉ锨逯屑尤虢K濃度為30%的硫酸銨，充分溶解，4℃ 沉淀過夜；次日4℃，12,000 r/min 離心15 min；棄上清，沉淀用10倍PBS溶解。按照改良Bradford法測定樣品蛋白含量，稀釋定量為1 μg/μL。

1.2.5 蛋白電泳與免疫印跡

分別取陽性菌株細胞碎片蛋白、30%硫酸銨沉淀的上清蛋白、30%硫酸銨沉淀的GS115破碎細胞上清蛋白、30%硫酸銨沉淀的p8K重組GS115破碎細胞上清蛋白，滅活雞流感病毒H5亞型抗原，加入等量 2×SDS 上樣緩沖液混合，100℃ 煮沸10 min，12.5%聚丙烯酰胺凝膠，SDS-PAGE電泳。一張膠染色后脫色；另一張經(jīng)濕式電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，恒壓100V 45 min；水漂洗，加入0.5%脫脂乳PBS[Na2HPO4, 8 mM ; NaCl, 136 mM; KH2PO4, 2 mM; KCl, 2.6 mM]，室溫封閉 2 h；PBST[PBS，Tween-20, 0.05%(v/v) ]洗膜3次；加入 1∶50 稀釋的全病毒疫苗免疫雞血清，室溫結(jié)合 2 h。PBST洗膜3次；加入 HRP-兔抗雞 IgY(1∶1 000稀釋)，37℃作用 2 h；PBST洗膜3次，置入顯色液[ 0.01 mol/L Tris-HCl, pH 7.6; 0.05%二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，臨用時加入10 μL 30% H2O2)]，室溫下顯色15 min，水漂洗終止反應，觀察結(jié)果。

1.2.6 蛋白含量測定

SDS-PAGE電泳膠染色后脫色，將western-blot驗證陽性的條帶與SDS-PAGE電泳膠對應，采用Image J軟件測定各條帶相對量，按照改良Bradford法測定樣品蛋白含量。最后按照公式：HA、M1和NA蛋白量=樣品蛋白總量×目標蛋白純度系數(shù)×100%，確定HA、M1和NA蛋白量，三者合計為VLPs粗含量。

1.2.7 電鏡觀察VLPs

取免疫印跡陽性的蛋白為電鏡樣品，磷鎢酸負染色，吸附于銅網(wǎng)，于JEM-1200EX透射電鏡下200 000×觀察。

1.2.8 動物免疫與抗體檢測

取100 μg/mL的30%硫酸銨沉淀的重組陽性菌株破碎細胞上清蛋白，加入等量MONTANIDE ISA 206 VG佐劑，充分乳化混勻。選取21～28日齡SPF雛雞，購自濟南斯帕法斯家禽有限公司，30只隨機分為6組。其中，油佐劑重組VLPs免疫組3組，每組5只，每組分別100、200和500 μL/只，胸部肌肉注射；陽性對照組5只，禽流感滅活疫苗，500 μL/只，胸部肌肉注射；陰性對照組5只，油佐劑重組空載體酵母蛋白，500 μL/只，胸部肌肉注射；空白對照組5只，PBS與等量佐劑混合物，500 μL/只，胸部肌肉注射。免疫后第0、1、3、6、10周(weeks post-immunization,wps)采集全血，分離血清，各組內(nèi)血清混合，血凝(HA)和血凝抑制試驗(HI)檢測抗體效價[參考《高致病性禽流感診斷技術(shù)(GB/T 18936-2003)》]。表2

2 結(jié)果與分析

2.1 多拷貝重組載體與表達質(zhì)粒

研究表明，該序列與巴斯德畢赤酵母GS115株18S rDNA(GenBank: FN392325.1)部分序列一致，全長1 292 bp；多拷貝整合載體p8K長度為8 302 bp，插入流感病毒HA、M和NA基因后，NotI酶切鑒定表達質(zhì)粒，長度分別達到10.0 Kb、9.3 Kb和9.6 Kb。測序結(jié)果也與目標序列一致。 圖1

注：1.Gene Ruler 1Kb plus DNA Ladder，2. 質(zhì)粒p8K-NA，3. 質(zhì)粒p8K-M，4. 質(zhì)粒p8K-HA，5. 質(zhì)粒p8K，6. 質(zhì)粒pPIC9K對照

2.2 重組酵母菌株篩選

分別挑取在3 mg/mL G418的YPD平板上生長的單菌落數(shù)個，培養(yǎng)后以蝸牛酶-蛋白酶K-SDS法抽提基因組DNA，同時設(shè)立陰性和空白對照，PCR擴增HA/M/NA基因。研究表明，有2個重組酵母基因組出現(xiàn)了HA、M和NA目標條帶，陰性和空白對照無相應條帶。將陽性重組菌株命名為rAI-a/1和rAI-a/2。圖2

圖2 重組酵母PCR篩選與鑒定

2.3 蛋白表達

研究表明，重組菌株蛋白條帶與陰性、空白對照有顯著差異。細胞碎片與上清中均出現(xiàn)64 KD、49 KD、28 KD 3條完全不同于陰性、空白對照菌株的條帶，且該3條蛋白大小與HA、NA和M1蛋白分子量理論預期值基本一致。病毒對照也成立。重組菌株rAI-a/1能夠有效表達HA、M1和NA蛋白。圖3

注：1. 蛋白質(zhì)Marker；2. GS115酵母蛋白；3. p8K重組GS115酵母蛋白；4. 禽流感病毒H5亞型抗原；5. 重組菌株rAI-a/1細胞碎片，6. 重組菌株rAI-a/1 30%硫酸銨沉淀破碎細胞上清

2.4 VLPs組裝

濃度為100 μg/mL的重組蛋白，經(jīng)ImageJ軟件測定HA、M1和NA條帶相對量，確定病毒樣顆粒含量為(10±2) μg/mL。研究表明，病毒樣顆粒大部分呈現(xiàn)近似圓形，但也有長條狀的，形態(tài)具有多形性，但整體結(jié)構(gòu)完整清晰，直徑約為80～120 nm，與禽流感病毒顆粒形態(tài)基本一致。圖4

圖4 電子顯微鏡觀察VLPs

2. 5 重組蛋白免疫原性

研究表明，重組VLPs免疫組與滅活疫苗免疫組，免疫后第0、1、3、6、10周，血清抗體血凝抑制效價逐步上升，至第3～6周達到峰值，后逐步下降。PBS與空載體重組酵母蛋白免疫雛雞的血凝抗體水平始終<2-1。重組VLPs免疫組血凝抑制價略低于全病毒滅活疫苗組，但與空載體和空白對照組差異顯著。表3

表3 重組蛋白血凝抑制抗體效價

3 討 論

在細胞內(nèi)同時表達多個病毒結(jié)構(gòu)蛋白，有望組裝為不含基因組的病毒樣顆粒(virus like particle，VLPs)。 病毒VLPs形態(tài)上類似天然病毒顆粒，抗原表位構(gòu)象接近天然構(gòu)象，被抗原遞呈細胞識別和遞呈給效應細胞，刺激機體產(chǎn)生獲得性免疫反應[12]。高危病原的全病毒滅活疫苗的生產(chǎn)過程，需要在生物安全三級標準的車間進行，工藝流程長、勞動強度大、成本高。特別是像H5N1亞型禽流感病毒，VLPs疫苗無疑是最好的選擇。流感病毒VLPs多被選擇在哺乳動物細胞、草地貪夜蛾細胞sf9中表達，優(yōu)點是蛋白結(jié)構(gòu)接近其天然構(gòu)象，免疫原性強，不足之處是工藝復雜，成本高，表達量偏低[6-8]。流感病毒VLPs在酵母細胞中有效表達和組裝，卻鮮有研究報告提及[9]。在研究中，構(gòu)建多拷貝整合載體，將M與HA、NA 基因同時在酵母細胞內(nèi)共表達，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定、誘導表達等多個環(huán)節(jié)，最終組裝成功了抗原性與天然顆粒接近的禽流感H5N1亞型VLPs。

A型流感病毒主要通過抗原轉(zhuǎn)換(antigenic shift)和抗原漂移(antigenic drift)方式變異，特別是HA和NA基因。由于抗原漂移導致新毒株的產(chǎn)生，動物群體缺少或無抗體保護而常造成流行。因此，疫苗使用的主要問題是毒種的選擇，生產(chǎn)毒株力求與流行株相匹配。與哺乳動物細胞、桿狀病毒介導的sf9細胞表達系統(tǒng)等相比較，酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)周期短，能更好的響應病毒的變異。但是，酵母表達的蛋白可能會出現(xiàn)不同于天然構(gòu)象的結(jié)構(gòu)，例如糖基化位點、糖鏈長度、糖鏈成分的差異，導致酵母源VLPs的免疫原性降低[9]。研究中來源于畢赤酵母的VLPs，具有較高的免疫原性，提示蛋白結(jié)構(gòu)接近于其天然構(gòu)象。

流感疫苗雖然不能完全阻止病毒感染接種動物，但能降低動物感染病毒的幾率，顯著改善臨床癥狀，并降低病毒發(fā)生基因重組的機會，從而減弱新型流感病毒大流行的危險性。在酵母表達組裝的禽流感VLPs成分中，盡管HA、NA不決定VLPs的基本結(jié)構(gòu)，但卻是流感病毒最重要的2個抗原蛋白[13-15]。一般地，在AIV 顆粒表面，HA與NA數(shù)量比率在4～5∶1；M2與HA數(shù)量比率在1∶10～100；M1是病毒粒子中含量最豐富的蛋白質(zhì)，約占病毒總蛋白的40%左右[11]。綜合考慮以上數(shù)量比率，再結(jié)合p8K-HA/M/NA質(zhì)粒的大小與電轉(zhuǎn)化效率的反比率關(guān)系，研究將p8K-HA∶p8K-M∶p8K-NA 三者比率初步確定為4∶10∶1(v/v)，試驗結(jié)果也支持該質(zhì)粒比率能夠有效轉(zhuǎn)化、重組表達并組裝AIV、VLPs，但未必是最優(yōu)組合比率。3個質(zhì)粒最優(yōu)組合比率，尚需要深入研究。

在研究的免疫印跡試驗中，M1條帶的灰度顯著低于HA和NA蛋白的，可能并不表明M1的表達量低于HA 和NA，而是M1蛋白位于顆粒的內(nèi)部，免疫原性和反應原性較低的緣故。實際上，M1單獨也可以組裝為衣殼結(jié)構(gòu)，其表面鑲嵌的刺突蛋白HA和NA的數(shù)量和結(jié)構(gòu)，決定該VLPs免疫原性的高低[16-17]。在研究的免疫試驗中，VLPs免疫效果低于滅活全病毒的，人工組裝VLPs表面的刺突數(shù)量不足、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定可能是一個重要因素[18-20]。如何提高VLPs的免疫原性，尚需要深入研究。

酵母細胞表達病毒樣顆粒，大部分情況下都是收集破碎細胞上清，獲得重組蛋白后再純化。但是，在研究中，細胞碎片中始終存在大量重組蛋白，這個現(xiàn)象提示，禽流感VLPs可能吸附在細胞骨架或者內(nèi)膜上，常規(guī)的凍融、振蕩等方法難于完全分離。

4 結(jié) 論

4.1將巴斯德畢赤酵母18S rDNA部分序列作為重組同源臂，插入載體pPIC9K構(gòu)建成功的多拷貝整合質(zhì)粒p8K，能攜帶外源基因多拷貝整合于巴斯德畢赤酵母基因組。以p8K為載體，將禽流感病毒 H5N1亞型HA、M和NA基因分別插入該質(zhì)粒構(gòu)建的表達質(zhì)粒，在終濃度均為1 μg/μL的條件下，按4∶10∶1(v/v)的比例混合、線性化、電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母，經(jīng)遺傳霉素G418加壓篩選，能夠獲得多拷貝重組菌株。

4.2多拷貝重組菌株經(jīng)誘導表達、高壓均質(zhì)破碎和硫酸銨沉淀上清收獲的重組蛋白，免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)64 KD、49 KD、28 KD 3條特異條帶，與HA、NA和M1蛋白分子量理論預期值基本一致；電鏡下可觀察到大部分呈近似圓形、也有長條狀的、形態(tài)具有多形性的、直徑約為80～120 nm的VLPs。該VLPs免疫雛雞，血清抗體血凝抑制效價至第3～6周達到峰值2-6，該VLPs具有良好的免疫原性。

4.3巴斯德畢赤酵母能高拷貝整合、表達、組裝禽流感病毒H5N1亞型VLPs，且該VLPs具有良好的免疫原性。