METTL3調控SPRING1促進巨噬細胞脂質蓄積

賈波，楊宙，喻廣力，呂運成，彭田紅

1.南華大學衡陽醫學院應用解剖與生殖研究所，湖南 衡陽 421001；2.桂林醫學院廣西糖尿病重點實驗室，廣西 桂林 541001

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性血管炎性病理過程，世界范圍內與其相關的心腦血管疾病發病率居首位[1,2]。巨噬細胞是AS損害過程中最為重要和豐富的免疫細胞，泡沫細胞形成是AS的標志性病理表現[3,4]。甲基轉移酶3（methyltransferaselike 3，METTL3）作為重要的N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine modification，m6A）修飾的寫入蛋白，催化反應性甲基化合物中的甲基基團并轉移到其第6個位置N原子上形成m6A修飾[5]，進而影響底物RNA的穩定性、剪接、轉運、定位和翻譯[6,7]。研究證實，METTL3催化的m6A修飾通過調控脂代謝相關基因表達影響胞內脂質含量：METTL3修飾可上調硬脂酰輔酶a去飽和酶1（SCD-1）mRNA水平，促進脂質合成，從而升高肝脂質水平[8]。SPRING1是一種新型的脂質生成調節因子，有文獻報道，SPRING1通過調節SREBPs表達，加速細胞內脂質的合成及攝取，促進肝細胞的脂質蓄積[9,10]。但目前對SPRING1表達的調控研究鮮有報道。鑒于m6A修飾可廣泛影響脂代謝相關基因的表達，而SPRING1是調控脂質代謝的重要因子，與肝細胞內脂質水平密切相關，因而探討METTL3是否可以調控SPRING1表達則顯得十分必要。本研究探討METTL3對SPRING1的調控作用及機制，觀察其通過SPRING1對THP-1細胞脂質蓄積的影響，以期為揭示METTL3介導的甲基化影響巨噬細胞脂質蓄積的作用及潛在機制提供新的研究思路，為維持巨噬細胞膽固醇平衡和抗動脈粥樣硬化的治療策略提供以METTL3為靶點的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 細胞培養與處理

THP-1細胞購自美國模式菌種收集中心ATCC。復蘇細胞后，于超凈臺中配置好完全培養基（胎牛血清：RPMI-1640培養基＝1：9），將細胞接種于完全培養基中。然后置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。每次實驗處理前用160 nmol/L佛波酯（phorbol12-myristate13-acetate，PMA，購自Sigma公司）孵育24 h誘導其分化為貼壁的巨噬細胞。

1.2 研究方法

1.2.1 Western blot檢測蛋白表達 收集細胞并提取蛋白，BCA測定蛋白濃度并配平后，根據目的蛋白的分子量，選擇配置適宜濃度的分離膠。恒壓80 V電泳30 min后轉恒壓120 V電泳60 min。根據檢測的目的蛋白的分子量，對比彩色蛋白預染分子量marker選擇相應的切膠區域；裁剪尺寸適合的PVDF膜（膜預先用無水甲醇激活至少15 s）；按照由下到上：海綿濾紙、PVDF膜、膠、海綿濾紙的順序擺放整齊；恒壓13 V、45 min，半干轉。轉膜完成后用封閉液封閉15 min后，METTL3（2000：1）或SPRING1（2000：1）抗體孵育，置于搖床上，4℃孵育過夜。隨后TBST漂洗5 min×3次，室溫搖床孵育羊抗兔IgG（5000：1）抗體2 h。TBST溶液洗膜5 min×3次。提前將ECL化學發光檢測試劑A、B液按1：1配制成ECL工作液。PVDF膜蛋白面向上，將ECL工作液涂抹于PVDF膜上，Tanon MP凝膠成像系統顯影分析。用Image J軟件分析灰度值，結果所示的光密度值與內參β-tubulin對比并進行半定量分析。

1.2.2 脂質攝取實驗 將THP-I細胞培養于24孔板內進行爬片，經160 ng/mL PMA誘導細胞貼壁后，換不含血清的1640培養基培養12 h；種板細胞用高壓蒸汽滅菌過的PBS浸洗2次后，換無血清培養基。同時，加入細胞膜紅色熒光標記探針LDL（DiI-Ac-LDL），確保DiI-Ac-LDL的培養濃度為25μg/mL；于細胞培養箱培養4 h，棄去培養基，再用滅菌后的PBS洗3遍，以清除殘留的DiI-Ac-LDL（此步驟需注意避光操作）。然后，用4%的多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，以清除殘留多聚甲醛。最后用含DAPI染色液的抗熒光淬滅封片劑進行封片15～30 min，并用熒光顯微鏡觀察采集圖像。

1.2.3 qRT-PCR檢測mRNA水平 根據所購試劑說明書提取細胞總RNA（注意保持實驗溫度，避免RNA降解）。然后用試劑盒測其濃度和純度，并篩選處于光密度值260～280 OD范圍（比值1.8～2.2）的樣本，用于合成反轉錄互補DNA。實驗所用引物，均由Primer 5.0軟件設計，隨后交由上海吉瑪制藥技術有限公司進行合成：SPRING1正引物：5’-ACTTGGGCAATAGCAGTCGTC-3’；SPRING1反 引物：5’-GCAAACGTAGCCGAGTTCAT-3’。使 用TaKaRa RT-PCR試劑盒，在實時定量PCR儀（購自美國BioRAD公司）中進行實驗，95℃作用3 min后，采用3步法PCR如下：變性，95℃30 s；退火，58℃30 s；延伸，72℃30 s，共35個循環。溶解曲線：95℃0 s變溫速度20℃/s，55℃15 s變溫速度20℃/s，95℃0 s變溫速度0.1℃/s。根據溶解曲線和所有結果，使用比較循環閾值（CT）（2-ΔΔCt）方法定量RNA的相對量，tubulin用作內部對照。

1.2.4 高效液相色譜分析 收集各處理組細胞，加入裂解液裂解后，用BCA試劑盒檢測其總蛋白濃度。然后，加入15%氫氧化鉀溶液，震蕩器混勻，再加入三氯乙酸用以沉淀蛋白質，取上清備用。采用C18色譜柱和C18保護柱測定樣本總膽固醇（total cholesterol，TC），膽固醇酯（cholesterol ester，CE）和游離膽固醇（free cholesterol，FC，加入氧化酶后產生），并保存結果，以蛋白內參校準，統計峰面積，最后計算膽固醇酯與總膽固醇比值。

1.2.5 細胞轉染 METTL3慢病毒載體（LVMETTL3）和METTL3的shRNA序列（LV-shMETTL3）由上海吉凱基因化學技術有限公司構建并進行純化。按照說明書，向脂質孵育THP-1細胞（1×106個細胞/孔）轉染相應慢病毒載體24 h，并保持病毒的最佳滴度。轉染24 h后換液（時間可延長至48 h），檢測轉染效率并進行后續實驗。

1.2.6 生物信息學分析 在NCBI數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）輸入SPRING1基因名，查找下載其全長FASTA序列（人和鼠）；在SRAMP數據庫（http://www.cuilab.cn/sramp/）輸入SPRING1（人和鼠）全長FASTA序列，用以預測全長轉錄本序列中m6A位點；在 RMBase數據庫(http://rna.sysu.edu.cn/rmbase/）輸入SPRING1基因名，預測全長轉錄本序列中m6A位點，相關的甲基化酶及識別酶。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 脂質孵育的巨噬細胞中METTL3和SPRING1的表達上調

2.1.1 脂質孵育巨噬細胞并觀察METTL3和SPRING1表達 為探究METTL3和SPRING1在巨噬細胞中的表達情況，用蛋白質免疫印跡檢測蛋白水平，qPCR檢測mRNA水平。結果顯示，與對照組相比，Ac-LDL孵育巨噬細胞后，METTL3蛋白水平顯著上調，SPRING1 mRNA和蛋白水平明顯升高（圖1）。以上結果提示，脂質孵育巨噬細胞中METTL3和SPRING1的表達上調。

圖1 50μg/ml Ac-LDL處理巨噬細胞后METTL3及SPRING1表達的變化（*P＜0.05，與對照組比較）A：Ac-LDL孵育的巨噬細胞中，METTL3蛋白水平較正常組顯著上調 B、C：Ac-LDL孵育的巨噬細胞中，SPRING1 mRNA和蛋白水平較正常組顯著上調Fig.1 Changes in the expression of METTL3 and SPRING1 after treatment of macrophages with 50μg/ml Ac-LDL（*:P＜0.05 vs Control group）A:METTL3 protein level significantly upregulated compared with the normal group in Ac-LDL incubated macrophages;B,C:SPRING1 mRNA and protein levels significantly upregulated compared with thenormal group in Ac-LDL incubated macrophages

2.1.2 構建脂質孵育巨噬細胞METTL3高表達及低表達模型 為探究THP-1細胞中METTL3和SPRING1的關系，構建脂質孵育巨噬細胞METTL3高表達及低表達模型并觀察SPRING1表達。首先檢測轉染效率，顯示轉染成功；進一步檢測SPRING1表達情況，結果顯示，高表達METTL3后，SPRING1的蛋白水平明顯上調，沉默METTL3后SPRING1蛋白水平明顯降低（圖2）。以上結果說明，METTL3上調控巨噬細胞SPRING1蛋白表達。

圖2 脂質孵育巨噬細胞轉染LV-METTL3及LV-shMETTL3構建METTL3高表達及低表達模型（*P＜0.01，與LV-對照組比較）A：干預METTL3表達，檢測其蛋白水平 B：干預METTL3表達檢測SPRING1表達變化Fig.2 Lipid-incubated macrophages were transfected with LV-METTL3 and LVshMETTL3 to construct high and low METTL3 expression models(*:P＜0.01 vs LV-Control)A:Protein level was detected after intervening in the METTL3 expression;B:Changes of SPRING1 expression was detected after intervening in the METTL3 expression

2.2 抑制甲基化水平會降低SPRING1表達

2.2.1 環亮氨酸抑制SPRING1表達 由于METTL3是甲基化重要的催化酶，因而其對SPRING1調控可能是通過m6A修飾進行。使用m6A抑制劑環亮氨酸（Cycloleucine，CL）處理脂質孵育巨噬細胞，觀察SPRING1的表達。結果顯示，與LV-METTL3組相比，加入CL并不影響METTL3的表達；但是，加入CL會抑制由過表達METTL3所致的SPRING1升高（圖3）。以上結果說明，METTL3可能通過m6A修飾上調巨噬細胞SPRING1水平。

圖3 脂質孵育巨噬細胞轉染LV-METTL3及環亮氨酸CL處理（*P＜0.01，與LV-對照組比較#P＜0.05，與LV-METTL3組比較A：過表達METTL3并用CL抑制甲基化，檢測METTL3蛋白水平B：過表達METTL3并用CL抑制甲基化，檢測SPRING1蛋白水平Fig.3 Lipid-incubated macrophages were transfected with LV-METTL3 and treated with cycloleucine CL(*:P＜0.01 vs LV-Control group;#:P＜0.05 vs LV-METTL3 group）A:METTL3 protein level was detected after overexpression of METTL3 and adding CL;B:SPRING1 protein level was detected after overexpression of METTL3 and adding CL

2.2.2 SPRING1 mRNA有m6A修飾位點 使用生物信息學軟件分析人和鼠SPRING1 mRNA序列，以檢測是否有m6A修飾位點。生信網站NCBI、SRAMP和RMBase數據庫查找并分析SPRING1 mRNA序列，結果顯示，SPRING1 mRNA具有m6A修飾的共有序列“GGACU”、“GAACU”及“GGACC”（表1）。以上結果進一步說明，METTL3通過m6A修飾上調巨噬細胞SPRING1水平。

表1 SRAMP分析人和鼠SPRING1-mRNA-m6A修飾位點Tab.1 SRAMPdatabase analysis SPRING1-mRNA-m6A modification sites of human and mouse

2.3 METTL3調控SPRING1水平促進巨噬細胞脂質蓄積

由于SPRING1主要影響細胞對脂質的攝取，而脂質攝取實驗顯示轉染LV-METTL3后巨噬細胞內Dil-Ac-LDL升高，轉染LV-METTL3并加入CL后巨噬細胞內Dil-Ac-LDL含量降低（圖4）；高效液相色譜法檢測細胞內的脂質，結果顯示同樣的變化趨勢（表2）。以上結果說明，METTL3上調SPRING1水平可促進巨噬細胞脂質蓄積。

圖4 過表達METTL3并用CL抑制甲基化，檢測巨噬細胞攝取Dil-Ac-LDL情況Fig.4 Detection of macrophagesuptakeof Dil-Ac-LDLafter overexpression of METTL3 and adding CL

表2 干預METTL3及CL處理對巨噬細胞脂質含量的影響（，mg/g）Tab.2 Effect on lipid content of macrophages after intervening of METTL3 and adding CL(Mean±SD,mg/g)

表2 干預METTL3及CL處理對巨噬細胞脂質含量的影響（，mg/g）Tab.2 Effect on lipid content of macrophages after intervening of METTL3 and adding CL(Mean±SD,mg/g)

注：*P＜0.05與LV-對照組比較#P＜0.05與LV-METTL3組比較Note:TC,total cholesterol;FC,free cholesterol;CE,cholesterol ester*:P＜0.05 vs LV-Control group;#:P＜0.05 vs LV-METTL3 group

3 討論

動脈粥樣硬化（AS）是一種復雜的心血管病理變化，由脂質代謝紊亂和炎癥引起，是心肌梗死和腦卒中的重要原因，已成為世界范圍內威脅人類健康的主要疾病之一[11,12]。血管壁中低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）和極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）殘余顆粒的滯留、積聚促進AS的發生[13]。過量的LDL隨即進行氧化或者其他化學修飾，氧化型的LDL能誘導血管發生炎癥反應，進而招募巨噬細胞將其吞噬，最終形成泡沫細胞，加速病變進程[14]。目前，作為研究熱點的m6A轉錄后修飾通過影響RNA結構、代謝和翻譯，對調節靶標基因的表達至關重要。本研究探討m6A修飾在巨噬細胞脂質代謝中的作用機制，揭示甲基化酶METTL3對巨噬細胞SPRING1表達，膽固醇蓄積的影響及調控機制。本研究初步闡明METTL3通過m6A修飾在轉錄后水平促進巨噬細胞SPRING1表達，從而促進巨噬細胞脂質蓄積和泡沫細胞的形成。

m6A修飾作為最豐富的RNA表觀遺傳修飾，已顯示在各種基本生物學過程和多種疾病諸如脂質代謝、胚胎發生、癌變和神經發生等發揮重要作用[15,16]。m6A RNA廣泛分布在不同的組織中，在人、小鼠和豬的肝中均已鑒定出“GRACH”基序[17]。METTL3耗竭介導的m6A降低導致代謝相關基因的RNA延長半衰期，從而保護小鼠免受HFD誘導的代謝綜合征的侵害。m6A mRNA修飾在脂肪形成中的重要作用毋庸置疑，但其具體機制尚待探索。本研究創新性發現METTL3可調控新靶標SPRING1，參與巨噬細胞脂質代謝及AS發生發展的調控。SPRING1是一種糖基化的高爾基體膜駐留蛋白，是固醇調節元件結合蛋白（SREBPs）的重要調節因子。文獻報道，SPRING1結合S1P，介導S1P的激活，促進其對底物SREBP前體的剪切，進而影響成熟的核SREBPs水平[18]。研究顯示，在Hap1及Hepa1-6人肝癌細胞和鼠原代肝細胞中敲低SPRING1可減少SREBPs信號傳導，細胞膽固醇合成酶及游離膽固醇水平均顯著降低。對SPRING1下游調控已有報道，但目前尚未闡明SPRING1參與脂質代謝上游調控因子及機制。因此，本研究從m6A轉錄后修飾，開辟以SPRING1為靶點的上游調控機制的探索。

本研究首先在脂質孵育THP-1細胞中發現METTL3和SPRING1高表達；然后干預METTL3的表達，SPRING1蛋白水平隨之改變，初步證明METTL3對SPRING1表達的調控作用；接著用生物信息學分析及CL處理，進一步闡明METTL3通過m6A修飾上調巨噬細胞SPRING1水平；最后，通過脂質攝取實驗觀察METTL3上調SPRING1對巨噬細胞脂質蓄積的影響。然而m6A修飾除了參與脂質代謝，還參與炎癥的調控，METTL3能否通過m6A修飾影響炎癥進而影響AS發生發展；METTL3通過m6A修飾影響SPRING1的具體位點；以及m6A修飾是否影響其他脂質代謝因子，本研究未做進一步探討。對m6A修飾及其在巨噬細胞脂質代謝中以及AS進展中的研究任重道遠，還需深入研究。

總之，本研究通過生信分析和細胞實驗，初步闡明METTL3通過m6A修飾上調SPRING1表達，促進巨噬細胞脂質蓄積。本研究從轉錄后修飾角度出發，探討m6A mRNA修飾通過重要脂質調節因子SPRING1對巨噬細胞脂質代謝的影響和機制，為AS的預防和治療提供了新的思路和見解，有望成為防治AS的科研工作新的治療靶點。