新型機械敏感離子通道Piezo1和TRPV4蛋白siRNA雙沉默模式對骨關節炎大鼠模型的修復作用研究

周勇偉，章才華，李曉飛，蔡迅梓

1.浙江大學醫學院附屬第二醫院骨科，杭州 浙江 310000；2.浙江大學醫學院附屬金華醫院骨一科，金華 浙江 321000

骨關節炎（Osteoarthritis,OA）是臨床上的常見病、多發病，尤其是隨著我國老齡化社會結構的不斷深入，越來越多的老年患者長期受到OA的困擾，從而影響生活質量，甚至降低患者的壽命[1,2]。據流行病學統計分析結果顯示，至2019年底，我國新增的OA患者高達100多萬，其中女性患者多于男性[3]。目前，針對OA的治療主要采用“階梯療法”，而最有效的治療方案主要是人工全膝關節置換術。但是，人工膝關節假體有一定的使用壽命，過早的手術置換，會增加術后二次翻修的機會，從而加重患者家庭的經濟負擔，增加患者本身的痛苦[4,5]。隨著基因治療技術的不斷進步，利用siRNA技術靶向沉默疾病的關鍵基因已經越來越引起人們的關注。其中，經過美國FDA批準應用的siRNA藥物Onpattro已經應用于臨床，充分證明了基因治療在臨床治療上的巨大潛力[6]。機械牽張力學信號在骨科相關疾病的作用已經越來越引起人們的關注，其中新型機械通道蛋白Piezo1是最近發現的，與生物力學信號密切相關的跨膜蛋白分子[7,8]。有研究證明，Piezo1蛋白參與OA軟骨細胞的凋亡以及成骨細胞增殖和分化過程[9]。TRPV4蛋白也是瞬時受體電位通道家族(TRP)的重要成員之一，有研究表明，TRPV4可以介導機械力學信號，并且可以在軟骨細胞中廣泛表達[10]。本研究在此基礎上，利用siRNA干擾技術構建新型機械敏感離子通道Piezo1和TRPV4蛋白siRNA雙沉默載體，并且通過慢病毒轉染軟骨細胞，通過局部注射的方法干預OA動物模型，從而在實驗動物層面上觀察雙基因沉默模式對OA的治療作用，以期為臨床上OA的治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

胎牛血清購自以色列BI公司；DMEM及0.25%胰酶Trypsin購自美國Invitrogen公司；TRIZOL購自美國Invitrogen公司；氯仿、酒精及逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；電泳儀，Real-time熒光定量PCR儀購自美國Bio-rad公司，手術器械購自北京源德醫療器械有限公司；SPF級SD大鼠購自濟南齊魯實驗動物中心（SCXK（魯）2018-2892）。月齡6～7個月，體重398～412 g。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠來源軟骨細胞的培養 無菌條件下獲取SD大鼠的膝關節軟骨組織，利用眼科剪對關節鏡下獲得的軟骨組織塊修剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織，利用5%膠原酶處理4 h，2.5%胰蛋白酶處理30 min，經細胞篩分離后，加入混有20%胎牛血清（FBS）的DMEM培養基，置入37℃，5%CO2培養箱中進行培養，3 d換液1次，細胞融合率達80%以上時，進行細胞換代。

1.2.2 大鼠來源軟骨細胞的鑒定 本研究采用免疫組織化學染色的方法進行鑒定，檢測靶細胞中Aggrecan蛋白和Collagen II蛋白的表達。靶細胞經4%多聚甲醛固定后，PBST溶液清洗3次，每次5 min，1%HCL孵育30 min，PBST溶液清洗3次，每次5 min，3%雙氧水孵育20 min，PBST溶液清洗后4℃避光過夜孵育Aggrecan蛋白和Collagen II蛋白一抗，孵育時間＞12 h，PBST溶液清洗3次，每次5 min，二抗孵育30 min，避光。PBST溶液清洗后HRP-親和素孵育30 min，PBST溶液清洗3次，每次5 min，DAB染色10 min后光學顯微鏡下觀察。

1.2.3 siRNA-Piezo1干擾載體和siRNA-TRPV4干擾載體的構建 siRNA-Piezo1和siRNA-TRPV4干擾載體的構建和篩選由上海吉凱公司完成。首先通過Pubmed Genebank查詢Piezo1蛋白和TRPV4的基因序列以及ORF序列和3’-UTR序列。根據siRNA靶點設計原理，構建siRNA-Piezo1和siRNA-TRPV4的干擾序列。選取上海吉凱公司提供的hU6-MCSCMV-EGFP慢病毒載體作為酶切對象，加入siRNA干擾序列后，轉染大鼠來源軟骨細胞，進行克隆測定，然后進行質粒的抽提，慢病毒的包裝以備用。

1.2.4 慢病毒介導siRNA干擾載體轉染軟骨細胞以P2代軟骨細胞為靶細胞，待細胞融合率為80%以上時，利用2.5%胰蛋白酶處理2 min后提取細胞制備細胞懸液，然后接種于六孔板中，細胞密度為2×105個/ml，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中進行培養，3 d換液1次，細胞融合率達60%以上時，加入含有siRNA-Piezo1和siRNA-TRPV4干擾載體的慢病毒質粒，根據MOI=50來確定慢病毒的滴度和加載量。利用倒置熒光顯微鏡對慢病毒的轉染效率進行檢測，計算轉染率。根據公式：轉染率（100%）=綠色熒光細胞/白光細胞×100%。

1.2.5 SD大鼠骨關節炎模型的構建 本研究利用手術處理的方案構建骨關節炎的動物模型。以SD大鼠作為研究對象，麻醉方式為腹腔注射10%水合氯醛，然后進行常規去毛和備皮，以SD大鼠后腿膝關節為中心點，切開膝關節腔，然后利用眼科剪剪斷SD大鼠的前交叉韌帶和內側半月板，然后逐層縫合膝關節。術后連續3 d每天肌肉注射青霉素2×105U，2次/d。造模1周后以X射線片顯示關節內側間隙明顯變窄、關節面粗糙變形、邊緣有明顯骨贅、軟骨下骨骨密度增高鑒定模型成功[11]。

1.3 實驗分組

根據對SD大鼠模型的處理方案的不同，將SD大鼠分成6組，每組的實驗動物有3只。即空白對照組，SD大鼠不做處理；假手術組，SD大鼠單純打開膝關節后，不切斷交叉韌帶；模型組，SD大鼠切除交叉韌帶后，構建OA動物模型；siRNA-Piezo1組，SD大鼠OA模型構建成功后，加入轉染siRNA-Piezo1質粒的軟骨細胞，細胞量為5×105個/ml，加載量為2 ml；siRNA-TRPV4組，SD大鼠OA模型構建成功后，加入轉染siRNA-TRPV4質粒的軟骨細胞，細胞量為5×105個/ml，加載量為2 ml；雙基因沉默組：SD大鼠OA模型構建成功后，加入轉染siRNA-TRPV4質粒和siRNA-Piezo1的軟骨細胞，細胞量為5×105個/ml，加載量為2 ml。

1.4 動物模型的檢測

1.4.1 免疫組織化學染色 處理2周后，無痛苦處死SD大鼠，無菌條件下獲得膝關節軟骨組織，經4%多聚甲醛固定后，-80℃超低溫冰箱保存，冰凍切片機切片，厚度為20μm，PBST溶液清洗3次，每次5 min，1%HCL孵育30 min，PBST溶液清洗3次，每次5 min，3%雙氧水孵育20 min，PBST溶液清洗后4℃避光過夜孵育Aggrecan蛋白和Collagen II蛋白一抗，孵育時間＞12 h，PBST溶液清洗3次，每次5 min，二抗孵育30 min，避光。PBST溶液清洗后HRP-親和素孵育30 min，PBST溶液清洗3次，每次5 min，DAB染色10 min后光學顯微鏡下觀察。

1.4.2 HE染色 處理2周后，無痛苦處死SD大鼠，無菌條件下獲得膝關節軟骨組織，4%多聚甲醛固定24 h，50%-70%-80%-90%-100%梯度酒精脫水，二甲苯處理后制備石臘塊。切片機制備厚度4μm的切片，制備石臘切片，然后進行脫蠟處理，1%過碘酸水溶液氧化10 min，Schiff試劑染色30 min，蘇木精復染5 min，95%無水乙醇脫水后中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.4.3 番紅-固綠染色 處理2周后，無痛苦處死SD大鼠，無菌條件下獲得膝關節軟骨組織，4%多聚甲醛固定24 h，50%-70%-80%-90%-100%梯度酒精脫水，切片加入固綠染液，處理10 min，自來水進行漂洗，然后加入番紅染液，處理10 min，自來水進行漂洗。利用二甲苯進行處理后，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.4.4 熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測Piezo1，TRPV4，Aggrecan和Collagen IImRNA相對表達水平

利用胰蛋白酶收集上述各組細胞，經PBS溶液清洗3次，常溫離心機1500 rpm離心5 min，取沉淀，加入1 ml Trizol溶劑，提取細胞總RNA，保證RNA純度范圍為1.8-2.1，然后利用TaKaRa逆轉錄試劑盒的要求，采用20μl反應體系逆轉錄為cDNA，-80℃保存，采用TaKaRa熒光定量PCR試劑盒的要求，采用FTC-2000 RT-PCR系統和50μg反應體系對樣本DNA進行分析，溶解曲線確定Tm值為53.7℃，統計并記錄各組樣 本 的CT值，采 用2-△△CT法 對Piezo1，TRPV4，Aggrecan和Collagen II的mRNA相對表達水平。

1.5 統計學分析

應用統計學軟件（SPSS 21.0美國）進行數據學統計，定量資料采用均數±標準差（）表示，空白對照組，假手術組，模型組；siRNA-Piezo1組，siRNATRPV4和雙基因沉默組的HE染色，番紅固綠染色和Piezo1，TRPV4，Aggrecan和Collagen IImRNA相對表達量比較采用方差分析(F檢驗)，組間比較采用q檢驗，認為P＜0.05具有統計學差異。

2 結果

表1 靶基因的序列Tab.1 The oligo sequence of the target gene

2.1 大鼠來源軟骨細胞的培養和鑒定

結果顯示，原代大鼠來源軟骨細胞呈不規則形（見圖1 A），P2代軟骨細胞呈碎石路樣排列（見圖1B），甲苯胺藍染色和HE染色見圖1 C-D，免疫組織化學染色結果顯示，軟骨細胞標志蛋白Aggrecan蛋白和Collagen II蛋白染色陽性（見圖1 E-F）。

圖1 軟骨細胞的培養和鑒定 A:P0軟骨細胞 B:P2代軟骨細胞 C-D:軟骨細胞的甲苯胺藍染色和HE染色 E-F:軟骨細胞標志蛋白Aggrecan蛋白和Collagen II蛋白染色Fig.1 Culture and identification of chondrocytes A:The P0 chondrocytes;B:The P2 chondrocytes;C-D:Toluidine blue staining and HE staining of chondrocytes;E-F:Thestaining of Aggrecan protein and Collagen IIprotein

2.2 慢病毒介導siRNA質粒轉染軟骨細胞

結果顯示，慢病毒介導siRNA質粒（siRNAPiezo1，siRNA-TRPV4和雙基因siRNA沉默質粒）均可以轉染軟骨細胞，轉染效率均＞90%以上。RT-PCR檢測結果顯示，雙基因siRNA沉默質粒均可以沉默Piezo1和TRPV4的mRNA表達量（P＜0.05）。見圖2。

圖2 慢病毒介導siRNA質粒轉染軟骨細胞和Piezo1、TRPV4 mRNA的相對表達量A:慢病毒轉染結果B:Piezo1，TRPV4 mRNA相對表達量 注：*P＜0.05Fig.2 TherelativemRNAexpression of TRPV4 and Piezo1 in chondrocytestransfected with lentivirusmediated siRNAplasmidA:Result of lentiviral transfection;B:TherelativemRNA expression of Piezo1 and TRPV4;Note:*P＜0.05

2.3 HE染色結果

結果顯示，空白對照組和假手術組膝關節HE染色結果顯示，膝關節結構存在，軟骨面光滑。模型組膝關節結構已經完全破壞，siRNA-Piezo1組膝關節軟骨下骨成分存在，siRNA-TRPV4組膝關節軟骨結構欠清晰。雙基因沉默組修復效果明顯優于siRNAPiezo1組和siRNA-TRPV4組。膝關節HE染色的改良Minkin’s評分結果顯示，雙基因沉默組修復效果明顯優于siRNA-Piezo1組和siRNA-TRPV4組（P＜0.05）。見圖3和表2。

表2 膝關節HE染色的改良Minkin’s評分結果Tab.2 The modified Minkin's score of HE staining of knee joint

圖3 HE染色結果 A:空白對照組B:假手術組 C:模型組D:siRNA-Piezo1組E:siRNA-TRPV4組F:雙基因沉默組Fig.3 Results of the HE staining A:The blank control group;B:The sham operation group;C:The model group;D:The siRNAPiezo1 group;E:ThesiRNA-TRPV4 group;F:Thedoublegene silencing group

2.4 番紅-固綠染色結果

結果顯示，空白對照組和假手術組膝關節番紅-固綠染色結果顯示，膝關節結構存在，軟骨面較厚，軟骨下骨結構存在。模型組膝關節結構紊亂，失去了正常結構。siRNA-Piezo1組膝關節軟骨下骨成分存在，siRNA-TRPV4組膝關節軟骨結構欠清晰。雙基因沉默組修復效果明顯優于siRNA-Piezo1組和siRNATRPV4組，見圖4和表3。

表3 膝關節番紅-固綠染色的OARSI評分結果Tab.3 The OARSI scores of knee joint stained with safranin and solid green

圖4 番紅-固綠染色結果A:空白對照組 B:假手術組 C:模型組 D:siRNA-Piezo1組 E:siRNA-TRPV4組 F:雙基因沉默組Fig.4 Results of safranine green stainingA:The blank control group;B：The sham operation group;C：The model group;D：The siRNA-Piezo1 group;E：The siRNATRPV4 group;F：Thedoublegenesilencing group

2.5 免疫組織化學染色結果

結果顯示，模型組膝關節組織中Aggrecan蛋白和Collagen II蛋白的含量要明顯低于空白對照組和假手術組（P＜0.05）。siRNA-Piezo1組和siRNA-TRPV4組膝關節組織中Aggrecan蛋白和Collagen II蛋白的含量要明顯高于模型組（P＜0.05）。雙基因沉默組膝關節組織中Aggrecan蛋白和Collagen II蛋白的含量要明顯高于siRNA-Piezo1組和siRNA-TRPV4組（P＜0.05），見圖5、圖6和表4。

表4 免疫組織化學染色結果Tab.4 Theresultsof theimmunohistochemical staining

圖5 各組大鼠膝關節膝關節組織中Aggrecan蛋白表達結果A:空白對照組B:假手術組C:模型組D:siRNA-Piezo1組E:siRNA-TRPV4組F:雙基因沉默組Fig.5 The Aggrecan protein expression in the knee tissues of rats in each groupA:The blank control group;B:The sham operation group;C:The model group;D:The siRNA-Piezo1 group;E:The siRNA-TRPV4 group;F:The double genesilencing group

圖6 各組大鼠膝關節組織中Collagen II蛋白表達結果A:空白對照組B:假手術組C:模型組D:siRNA-Piezo1組E:siRNA-TRPV4組F:雙基因沉默組Fig.6 The Collagen IIprotein expression in the knee tissues of rats in each groupA:The blank control group;B:The sham operation group;C:The model group;D:The siRNA-Piezo1 group;E:The siRNA-TRPV4 group;F:The doublegenesilencing group

2.6 RT-PCR結果顯示Piezo1，TRPV4，Aggrecan和Collagen II mRNA相對表達水平

結果表明，siRNA-Piezo1組可以沉默Piezo1的mRNA表達量，增加Aggrecan和Collagen IImRNA相對表達量。siRNA-TRPV4組可以沉默TRPV4的mRNA表達量，增加Aggrecan和Collagen IImRNA相對表達量。并且，雙基因沉默組中Aggrecan和Collagen IImRNA相對表達量明顯高于siRNA-Piezo1組和siRNA-TRPV4組（P＜0.05）。見圖7。

圖7 RT-PCR結果顯示Piezo1、TRPV4、Aggrecan和Collagen IImRNA相對表達水平Fig.7 The results of the RT-PCR showed the relative mRNA expression levels of Piezo1,TRPV4,Aggrecan and Collagen II

3 討論

骨關節炎是臨床上的常見病、多發病。隨著我國老齡化社會的不斷深入，OA患者的發病率也越來越高。目前針對OA的治療尚缺乏安全有效的治療方案，因此，亟需對OA的發病機制進行研究，對OA治療方案進行革新。機械激活離子通道是一種與生物力學密切相關的通道蛋白，我們的前期研究表明，新型機械激活離子通道Piezo1與OA進展過程中軟骨細胞的過度凋亡密切相關，并且，利用siRNA-Piezo1質粒可以阻斷Piezo1的表達，通過ERK1/2信號通路介導軟骨細胞的凋亡[12]。但是，我們之前的研究僅局限于細胞層面，對于動物層面的研究尚未涉及，在本次研究中，我們通過手術干預的方法構建SD大鼠的OA動物模型，通過siRNA技術構建Piezo1和TRPV4的干擾質粒，通過慢病毒轉染軟骨細胞后，注射入膝關節內，觀察其對OA動物模型的干預效果，是否可以對OA的進展起到一定的阻滯作用。以期為臨床上OA的治療提供新的思路和方法。

既往研究表明，Piezo1蛋白的表達與骨關節炎（OA）患者膝關節軟骨細胞的凋亡密切相關，在牽張應力作用下，OA軟骨細胞中Piezo1蛋白的表達量明顯增加，而且可以通過ERK5信號通路介導軟骨細胞的過度凋亡，進而促進OA的進展[11]。也有研究表明，Piezo1蛋白的激活可以促進骨肉瘤細胞的侵襲和增殖，利用Piezo1蛋白抑制劑GsMTx4抑制Piezo1蛋白的表達后，可以抑制骨肉瘤細胞的增殖，抑制細胞的侵襲[13]。TRPV4蛋白離子通道也是近年來比較熱門的離子通道，可以介導流體力學和機械應力信號等，進而參與成骨細胞的分化，軟骨細胞的凋亡等[14]。在本研究中，我們利用siRNA技術構建Piezo1和TRPV4的干擾質粒，利用軟骨細胞作為載體，通過慢病毒轉染后，干預OA動物模型。通過HE染色和番紅-固綠染色等方法，利用改良Minkin’s評分和OARSI評分進行評估，結果提示，siRNA-Piezo1組和siRNATRPV4組膝關節軟骨組織的評分要明顯優于模型組，并且，雙基因沉默組修復效果明顯優于siRNAPiezo1組和siRNA-TRPV4組（P＜0.05）。結果說明，將機械激活離子通道Piezo1和TRPV4蛋白阻斷后，可以在一定程度上阻滯OA的進展，并且可能在一定程度上對軟骨組織起到一定的修復效果。另外，利用雙基因沉默模式，相較于單基因模式更具有優勢。是一種值得參考的方向。

多聚蛋白多糖（Aggrecan）和II型膠原蛋白（Collagen II）是軟骨細胞的特征性蛋白，有研究表明，可以通過檢測Aggrecan和Collagen II蛋白的表達來反應軟骨細胞的增殖和軟骨組織的修復情況[15]。在本研究中，我們利用免疫組織化學染色的方法，檢測原代軟骨細胞中Aggrecan和Collagen II蛋白的表達，從而對軟骨細胞進行鑒定。另外，我們還通過免疫組織化學染色的方法對OA動物模型膝關節的軟骨組織情況進行評估，結果表明，siRNA-Piezo1組和siRNA-TRPV4組中Aggrecan和Collagen II蛋白的表達量要明顯高于模型組，并且，雙基因沉默組中Aggrecan和Collagen II蛋白的表達量明顯高于siRNA-Piezo1組和siRNA-TRPV4組。同時，我們還利用RT-PCR技術檢測Aggrecan和Collagen IImRNA的表達量，結果與免疫組織化學染色結果相同，siRNAPiezo1組和siRNA-TRPV4組中Aggrecan和Collagen II的mRNA的表達量要明顯高于模型組，并且，雙基因沉默組中Aggrecan和Collagen II的mRNA表達量明顯高于siRNA-Piezo1組和siRNA-TRPV4組。結果說明，將機械激活離子通道Piezo1和TRPV4蛋白阻斷后，可以促進OA軟骨組織的修復，并且是通過增加Aggrecan和Collagen II表達量的方法來實現的。另外，利用雙基因沉默模式，相較于單基因模式對Aggrecan和Collagen II的表達更具有促進作用。

綜上所述，Piezo1和TRPV4蛋白siRNA雙沉默模式可以促進Aggrecan和Collagen II的表達，進而對骨關節炎大鼠模型起到一定的修復作用。