鳶尾素抑制JAK/STAT3通路促進(jìn)炎癥狀態(tài)下的血管生成

胡思涵，薛源，金葉盛，張?jiān)?，施勤，芮永?/p>

1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院蘇州大學(xué)骨科研究所，江蘇 蘇州 215006 2.蘇州大學(xué)附屬無錫第九人民醫(yī)院，江蘇 無錫 214026

大面積的皮膚軟組織缺損修復(fù)是創(chuàng)傷外科面臨的難點(diǎn)[1]，目前皮瓣已成為組織修復(fù)治療的重要手段，但是皮瓣移植術(shù)后會(huì)帶來新的并發(fā)癥，如血管痙攣以及組織缺血再灌注損傷等[2]。皮瓣的缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）損傷，可以直接造成移植區(qū)部分或全部缺血壞死，如何有效地避免IR損傷提高皮瓣存活率是亟待解決的問題[3,4]。學(xué)者通過不斷的臨床研究及探索，在血管定位、皮瓣供區(qū)選擇、受區(qū)處理等方面均有突破性的進(jìn)展；在微觀層面，多項(xiàng)基礎(chǔ)研究表明IR損傷過程為急性炎癥反應(yīng)，其嚴(yán)重影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，造成皮瓣的缺血壞死[5]。研究表明，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以通過NF-κB信號(hào)通路導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[6,7]，而鳶尾素（Irisin）可以減輕LPS誘導(dǎo)成熟脂肪細(xì)胞的炎癥狀態(tài)，并減少促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)[8]。鳶尾素是新型肌肉因子，運(yùn)動(dòng)可以促使其分泌，發(fā)揮多種生物學(xué)功能[9～11]。另有研究證明，鳶尾素在大鼠皮瓣缺血再灌注損傷模型中具有保護(hù)作用[12]，但其在急性炎癥下對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用尚不明確。本研究通過LPS誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）的急性炎癥，加入重組鳶尾素干預(yù)處理，觀察其遷移、血管生成能力，以及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，研究鳶尾素是否可以改善內(nèi)皮細(xì)胞功能并探究其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器 HUVEC為蘇州大學(xué)骨科研究所保種細(xì)胞株，DMEM-High培養(yǎng)基（HS30022.01）購自美國Hyclone公司，人重組鳶尾素（ADI-908-307-3010）購自美國Enzo Life Sciences，CCK-8試劑（貨號(hào)：CK-04）購自日本同仁化學(xué)研究所，光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：CX31）購自日本Olympus公司，全波長酶標(biāo)儀（型號(hào)：MODEL550）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（型號(hào)：ChemiDocXRS）購自美國Bio-Rad公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，待細(xì)胞融合率達(dá)到70%～80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)HUVEC增殖效率 使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）測(cè)定不同濃度鳶尾素對(duì)HUVEC增殖效率的影響。將HUVEC以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種在96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔，用不同濃度的鳶尾素（0、0.1、1.0、5.0、10.0 ng/ml）干預(yù)后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后，在第1、3、5 d取出細(xì)胞板，加入10%的CCK-8液100μl，置于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育2 h。在全波長酶標(biāo)儀上于450 nm波長測(cè)量吸光度，比較細(xì)胞的增殖并制作曲線。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將HUVEC以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種在6孔板中，分組為：對(duì)照組、對(duì)照組+鳶尾素組、LPS組、LPS+鳶尾素組。待細(xì)胞鋪滿孔板，用100 ng/mL的LPS預(yù)處理后兩組細(xì)胞12 h，隨后加入5 ng/mL重組鳶尾素，用移液槍頭垂直劃線，加入無血清培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按0、6、24 h取同一部位在光學(xué)顯微鏡下拍照觀察。

1.2.4 基質(zhì)膠管樣形成實(shí)驗(yàn) 將100 ng/ml LPS預(yù)處理12 h的HUVEC和正常狀態(tài)的細(xì)胞，以每孔2×104個(gè)按1.2.3分組接種于200μl基質(zhì)凝膠板，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在12、24、36、48 h通過光學(xué)顯微鏡觀察、拍照，并計(jì)算成管數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將HUVEC按上述1.2.3分組及LPS預(yù)處理，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，加入5 ng/ml重組鳶尾素，48 h后用Trizol提取總RNA并測(cè)量濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后采用SYBR Premix Ex Taq（BIO-RAD，USA）進(jìn)行RT-PCR。引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequencesfor quantitativereal-time PCR

1.2.6 Western blot 采用1.2.5中的方法進(jìn)行HUVEC的預(yù)處理、種板、干預(yù)。在72 h收集細(xì)胞并提取蛋白，測(cè)定所有樣本蛋白濃度。以每孔30 mg蛋白進(jìn)行電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，進(jìn)行封閉后裁剪相應(yīng)條帶，用Jak、Erk1/2、Stat3（Abcam ab108596，ab17942，ab68153）、β-Actin（AA128，碧云天）的一抗孵育過夜，次日進(jìn)行洗滌液漂洗3遍后孵育對(duì)應(yīng)種屬二抗，再次洗滌后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 鳶尾素不影響HUVEC增殖

選用濃度分別為0.1、1.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的重組鳶尾素干預(yù)HUVEC，通過CCK-8檢測(cè)增殖結(jié)果，可以看到在第1、3、5 d，各濃度的重組鳶尾素對(duì)HUVEC的增殖均無影響（圖1A、B、C，P＞0.05）。結(jié)合人體內(nèi)鳶尾素的含量[13]，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選用濃度為5.0 ng/mL以更好地模擬人體內(nèi)環(huán)境。

圖1 CCK-8檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各濃度的鳶尾素對(duì)HUVEC增殖的影響 A：第1天B：第3天C：第5天Fig.1 Effects of different concentrations of irisin on HUVECproliferation detected by CCK-8 at different time points A:The first day;B:Thethird day;C:Thefifth day,P＞0.05

2.2 鳶尾素促使HUVEC在LPS誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境下的細(xì)胞遷移

用100 ng/ml的LPS誘導(dǎo)HUVEC模擬炎癥狀態(tài)，并進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，同時(shí)加入鳶尾素進(jìn)行干預(yù)，分別在0、6、24 h觀察并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞間隙寬度的變化。隨著時(shí)間的變化，鳶尾素對(duì)誘導(dǎo)組的細(xì)胞遷移影響不大，而6 h后，LPS誘導(dǎo)明顯減弱了細(xì)胞遷移能力，鳶尾素干預(yù)后可以縮窄細(xì)胞間隙寬度（圖2），24 h該現(xiàn)象更為明顯。該結(jié)果說明鳶尾素在炎癥狀態(tài)下，增強(qiáng)了細(xì)胞的遷移能力。

圖2 鳶尾素在LPS誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境下對(duì)HUVEC遷移的影響A：對(duì)照組、對(duì)照+鳶尾素組、LPS預(yù)處理組、LPS預(yù)處理+鳶尾素組在0、6、24 h的劃痕實(shí)驗(yàn)光鏡圖，比例尺=100 μm B：劃痕寬度變化的定量圖（*P＜0.05***P＜0.005）Fig.2 Effect of irisin on HUVECmigration in LPS-induced inflammatory environmentA:Control,Control+irisin,LPSpretreatment,LPSpretreatment+irisin groups at 0,6 and 24 h,scale bar=100μm;B:Quantitativediagram of scratch width variation；(*P＜0.05，***P＜0.005)

2.3 鳶尾素可以促進(jìn)炎癥狀態(tài)下HUVEC的管樣形成

用LPS預(yù)處理HUVEC 12 h后可以看到HUVEC細(xì)胞排列散亂，加入鳶尾素可以明顯改善這種現(xiàn)象，數(shù)量和面積定量分析提示同樣結(jié)果；在24、36、48 h繼續(xù)進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，其結(jié)果與12 h一致（圖3）。該結(jié)果說明鳶尾素在LPS誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境下可以促進(jìn)HUVEC的管樣形成。

2.4 鳶尾素影響炎癥狀態(tài)下HUVEC的細(xì)胞因子的表達(dá)

首先通過LPS預(yù)處理HUVEC 12 h后用鳶尾素干預(yù)。48 h后的RT-PCR結(jié)果可以看到，炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6、TNF-α基因表達(dá)在LPS干預(yù)后顯著增加，鳶尾素可以抑制該表達(dá)上升（圖4A、B、C），而組織修復(fù)因子PDGF-BB在炎癥誘導(dǎo)后表達(dá)降低，加入鳶尾素后得到明顯改善（圖4D）。該結(jié)果說明重組鳶尾素可以顯著抑制促炎因子的分泌，增加組織修復(fù)因子的表達(dá)。

圖4 鳶尾素對(duì)炎癥狀態(tài)下細(xì)胞因子IL-1β（A）、IL-6（B）、TNF-α（C）、PDGF-BB（D）相關(guān)基因表達(dá)的影響***P＜0.005****P＜0.001Fig.4 Theeffect of irisin on theexpression of cytokinerelated genesin thestateof inflammation A-D:mRNA expression of IL-1β,IL-6,TNF-α,PDGF-BB(***P＜0.005，****P＜0.001)

圖5 Western blot檢測(cè)各組中Jak、Erk1/2、Stat3的蛋白表達(dá)Fig.5 The protein expressions of Jak,Erk1/2 and Stat3 detected by WB

2.5 鳶尾素抑制LPS誘導(dǎo)的JAK/STAT3通路激活

通過WB檢測(cè)Erk1/2、Jak、Stat3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HUVEC在LPS誘導(dǎo)后信號(hào)蛋白Jak、Erk1/2、Stat3表達(dá)增加，在加入重組鳶尾素后，表達(dá)明顯減弱，該結(jié)果說明，鳶尾素可以通過抑制JAK/STAT3通路削弱LPS誘導(dǎo)的HUVEC急性炎癥反應(yīng)。

3 討論

IR損傷是臨床組織修復(fù)過程中較為嚴(yán)重的并發(fā)癥，直接影響組織修復(fù)的效果，血管內(nèi)皮細(xì)胞的急性炎癥反應(yīng)是其主要原因[12]。本研究首先證明了鳶尾素不影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。在血管形成過程中，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移給血管新生提供足夠的細(xì)胞基礎(chǔ)，而在急性炎癥環(huán)境下，細(xì)胞缺乏正常生長所需的多種因子包括缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、VEGF、成纖維細(xì)胞生長因子2（FGF2）和PDGF等[14～16]，通過劃痕實(shí)驗(yàn)，在LPS誘導(dǎo)組，可以看到，直到24 h，劃痕寬度仍未有明顯縮窄，而鳶尾素可以有效增加急性炎癥狀態(tài)下HUVEC的遷移能力。

在組織修復(fù)過程中，血管形成是保證組織存活的基礎(chǔ)[17]，本研究驗(yàn)證了急性炎癥環(huán)境下HUVEC的成管能力。經(jīng)LPS誘導(dǎo)的HUVEC分布散亂，成管能力差，然而經(jīng)過重組鳶尾素的干預(yù)處理，在第12 h，HUVEC趨于管樣分布，與對(duì)照組相近，在后面的時(shí)間段中，其成管效果均明顯優(yōu)于LPS誘導(dǎo)組。在組織修復(fù)中特別是移植方面，早期的血管化對(duì)組織存活十分重要，而鳶尾素在急性炎癥狀態(tài)下，早期即可明顯促進(jìn)HUVEC的管樣形成，具有重要的臨床意義。

炎癥的發(fā)生發(fā)展，組織的再生修復(fù)需要許多細(xì)胞因子的參與[18]，有研究表明巨噬細(xì)胞可以通過產(chǎn)生活性氧破壞細(xì)胞代謝，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，加劇缺血損傷，從而加重組織損傷[19]。本研究探討了炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6、TNF-α及組織修復(fù)相關(guān)因子PDGF-BB的mRNA表達(dá)。經(jīng)LPS誘導(dǎo)，顯著增加了HUVEC中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平，而PDGF-BB降低明顯，加入鳶尾素后，這些現(xiàn)象均得到逆轉(zhuǎn)。該結(jié)果證明鳶尾素可以通過降低炎癥因子的表達(dá)，增加組織修復(fù)因子的表達(dá)，進(jìn)而改善炎癥狀態(tài)下HUVEC的功能。

Stat3在不同病理環(huán)境下對(duì)血管生成有重要調(diào)控作用[20]。在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，pvt1通過激活STAT3/VEGFA信號(hào)軸介導(dǎo)血管的生成[21]。本研究對(duì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行了初步探索，證明LPS可以激活HUVEC內(nèi)JAK/STAT3信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)蛋白Jak、Stat3、Erk1/2的表達(dá)，從而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄，而這種激活可以被鳶尾素抑制。這為后續(xù)的機(jī)制研究開拓了新的方向，有利于尋找新的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究證明鳶尾素在組織修復(fù)過程中的重要作用，為皮瓣等組織修復(fù)的臨床治療，有望縮短患者的病程，改善愈后。