改變中心碳代謝途徑對發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的影響

陳 寧 ，孫鵬杰，李瀾瀟，張玉富，徐慶陽

(1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

隨著L–亮氨酸市場需求的增加，微生物發(fā)酵法因其經(jīng)濟(jì)性和環(huán)境友好性成為生產(chǎn)L–亮氨酸的主要方法．最常見的用于生產(chǎn)L–亮氨酸的細(xì)菌是谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)和大腸桿菌(Escherichia coli)[1-2]．C. glutamicum是一種從土壤分離的需氧非致病性革蘭氏陽性細(xì)菌，由于一般公認(rèn)的安全狀態(tài)(generally recognized as safe，GRAS)和代謝能力，廣泛應(yīng)用于氨基酸生產(chǎn)行業(yè)，特別是用于L–谷氨酸、L–賴氨酸和支鏈氨基酸(BCAAs)的生產(chǎn)[3]. 在早期，大多數(shù)L–亮氨酸生產(chǎn)菌株是通過隨機(jī)誘變和選擇分離出來的．然而，這種方法既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，而且常常會(huì)引起基因組中不必要的改變[4]．目前，代謝工程基因改造已逐漸取代傳統(tǒng)的隨機(jī)誘變篩選的方法成為主流．已有研究者報(bào)道了基于代謝工程成功獲得L–亮氨酸生產(chǎn)菌的案例[5-12]．

L–亮氨酸的生物合成途徑在C. glutamicum中是復(fù)雜且受到嚴(yán)格調(diào)控的．谷氨酸棒桿菌中支鏈氨基酸合成途徑如圖1所示．由于3個(gè)BCAAs的生物合成途徑部分地共享相同的基因和酶[13]，糖酵解途徑(EMP)的最終產(chǎn)物丙酮酸是BCAAs的中心前體物.ilvBN編碼的乙酰羥基酸合成酶(AHAS)，也稱為乙酰乳酸合成酶，能催化丙酮酸與另一分子丙酮酸反應(yīng)生成2–乙酰乳酸或催化丙酮酸與2–酮丁酸生成2–乙酰–2–羥基丁酸，分別對應(yīng)L–纈氨酸合成途徑、L–異亮氨酸合成途徑[14]．此外，α–異丙基蘋果酸合成酶(IPMS)作為L–亮氨酸生物合成途徑的限速酶，受到L–亮氨酸反饋抑制和轉(zhuǎn)錄弱化，能催化α–酮異戊酸和乙酰輔酶A(AcCoA)轉(zhuǎn)化為α–異丙基蘋果酸[4]. 分析L–亮氨酸合成途徑可知，產(chǎn)生1分子L–亮氨酸需要1.5分子葡萄糖，其中1分子葡萄糖可以產(chǎn)生2分子丙酮酸、另外0.5分子用于生產(chǎn)1分子AcCoA[4].

圖1 谷氨酸棒桿菌中支鏈氨基酸合成途徑 Fig. 1 BCAAs biosynthesis pathway of C. glutamicum

AcCoA是許多工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)品的關(guān)鍵前體物，研究者往往通過增加其供應(yīng)量促進(jìn)其生物轉(zhuǎn)化為不同產(chǎn)品[15]．C. glutamicum細(xì)胞質(zhì)中合成AcCoA的天然途徑是丙酮酸脫氫酶(PDH)旁路[16]．近年來，利用磷酸轉(zhuǎn)酮酶(phosphoketolases，PKTs)和碳重排循環(huán)而設(shè)計(jì)的合成途徑，每分子果糖–6–磷酸能生成3分子AcCoA，成功地實(shí)現(xiàn)了糖代謝中的碳守恒，而通過EMP途徑每分子葡萄糖生成2分子AcCoA[17]. 目前，這個(gè)循環(huán)稱為非氧化糖酵解(non-oxidative glycolysis，NOG)，用于提高AcCoA相關(guān)產(chǎn)物的產(chǎn)量，如乙酸酯、丙酮、聚羥基丁酸酯、甲戊酸酯和L–谷氨 酸[18-25]．PKTs可催化木酮糖–5–磷酸/果糖–6–磷酸不可逆裂解為乙酰–磷酸(Ac-P)和甘油醛–3–磷酸或赤蘚糖–4–磷酸[21]．Ac-P轉(zhuǎn)化為AcCoA可能有兩種途徑，一是通過磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(Pta)或乙酸激酶(Ack)，二是通過乙酰輔酶A合成酶(Acs)[26]．除了增加前體物AcCoA的供應(yīng)，L–亮氨酸生產(chǎn)菌亦需要減少其不必要的消耗．AcCoA進(jìn)入TCA途徑被氧化生成CO2和能量[27]是AcCoA被消耗的主要方式．將編碼檸檬酸合酶(CS)的gltA基因前面的兩個(gè)天然啟動(dòng)子替換為較弱的啟動(dòng)子dapA-L1[5]，CS的活性降低16%，以提高AcCoA生產(chǎn)L–亮氨酸的代謝流．

生產(chǎn)效率的提高是經(jīng)濟(jì)性的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)過程的關(guān)鍵限制因素[28]．本研究在L–亮氨酸生產(chǎn)菌C. glutamicumCP中引入了一種來源于Bifidobacterium adolescentis的高活性突變體PKT[29]，旨在提高L–亮氨酸生產(chǎn)效率．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

L–亮氨酸生產(chǎn)菌C. glutamicumCP(CGMCC 11425)，克隆宿主Escherichia coliDH5α，質(zhì)粒pK18mobsacB、pXMJ19、pXT01(pXMJ19ΔlacI)均由天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏．本文構(gòu)建的質(zhì)粒與菌株見表1．

表1 質(zhì)粒與菌株 Tab. 1 Plasmids and strains

1.1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10．

Brain Heart Infusion培養(yǎng)基：3.85%腦心浸液肉湯培養(yǎng)基．

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米漿10，葡萄糖25，酵母粉5，豆餅水解液20，硫酸銨10，磷酸二氫鉀1.5，硫酸鎂1，硫酸亞鐵1，硫酸錳1，L-甲硫氨酸0.6，L-異亮氨酸0.2．

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒與工程菌構(gòu)建方法

PCR擴(kuò)增引物通過諾唯贊CE Design引物軟件設(shè)計(jì)，由金唯智公司合成，引物序列見表2．常規(guī)的分子克隆方法如PCR、DNA限制性內(nèi)切按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行[30]．C. glutamicum的基因改造方法參考文獻(xiàn)[5]．來源于青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)的高活性突變體PKT，其編碼基因?yàn)閒xpk，GenBank：MN081868.1，由金唯智公司合成．敲除及基因整合質(zhì)粒通過重疊PCR獲得基因片段，以pK18-ΔltbR∷Ptuf-fxpk為例，分別擴(kuò)增基因ltbR上下游同源臂、tuf啟動(dòng)子、fxpk和rrnB終止子，與線性化載體pK18mobsacB連接，驗(yàn)證正確后，電轉(zhuǎn)至C. glutamicumCP，經(jīng)過兩次同源重組，獲得工程菌．

表2 引物 Tab. 2 Primers

1.2.2 工程菌的培養(yǎng)方法

搖瓶發(fā)酵與補(bǔ)料分批發(fā)酵方法參考文獻(xiàn)[7]．搖瓶發(fā)酵：將活化的菌種，以10%接種量接種至30mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，200r/min、32℃振蕩培養(yǎng)．通過指示劑苯酚紅確定補(bǔ)加氨水和葡萄糖的時(shí)機(jī)和體積．補(bǔ)料分批發(fā)酵：培養(yǎng)種子液至菌體濃度A600為20～25，以20%接種量接種至3L發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度為32℃，通過調(diào)整轉(zhuǎn)速和通風(fēng)比使得溶解氧(DO)為20%～30%，pH為7.0，使用泡敵消除泡沫．當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度低于5g/L時(shí)，補(bǔ)充葡萄糖，維持葡萄糖質(zhì)量濃度為5～10g/L．

1.2.3 分析方法

通過分光光度計(jì)測定600nm下的吸光度，以確定C. glutamicum的菌體濃度．采用SBA-40C型生物傳感儀測定發(fā)酵液中的葡萄糖含量．產(chǎn)物L(fēng)–亮氨酸及副產(chǎn)物雜酸經(jīng)過衍生化處理后，通過高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行測定[31]．L–亮氨酸與L–丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，在一定濃度范圍，二者濃度與峰面積線性關(guān)系良好．

圖2 L–亮氨酸與L–丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig. 2 Standard curve of L-leucine and L-alanine

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS 18.0(IBM公司)對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析．所有數(shù)據(jù)均為3個(gè)重復(fù)的平均值．使用Student’s t-test比較不同處理的發(fā)酵性能差異，P＜0.05的差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 結(jié)果與討論

2.1 PKT的過表達(dá)對生產(chǎn)L–亮氨酸的影響

基因過表達(dá)的方式有組成型表達(dá)和誘導(dǎo)型表達(dá)兩種．分別以質(zhì)粒pXMJ19、pXT01為PKT的誘導(dǎo)型和組成型表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pXMJ-fxpk、pXTfxpk，轉(zhuǎn)化E. coliDH5α．陽性轉(zhuǎn)化子通過菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖3(a)所示，并進(jìn)一步通過測序驗(yàn)證. 將測序結(jié)果正確的pXMJ-fxpk、pXT-fxpk分別電轉(zhuǎn)至C. glutamicumCP，陽性轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖3(b)所示．將驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，測序驗(yàn)證．經(jīng)比對測序結(jié)果與已知目的基因序列一致，結(jié)果表明成功構(gòu)建PKT過表達(dá)的菌株CP01、CP02．

圖3 質(zhì)粒pXMJ-fxpk、pXT-fxpk及菌株CP01、CP02的構(gòu)建 Fig. 3 Construction of plasmids pXMJ-fxpk and pXTfxpk and strains CP01 and CP02

對出發(fā)菌CP、工程菌CP01和CP02進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以確定過表達(dá)PKT對L–亮氨酸生產(chǎn)菌的影響．3株菌的搖瓶發(fā)酵條件相同，其中CP01、CP02使用的培養(yǎng)基添加了相應(yīng)的抗生素，以避免菌株生長過程質(zhì)粒丟失．三者搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖4所示(*P＜0.05，**P＜0.01)，發(fā)酵48h，菌株CP、CP01、CP02的L–亮氨酸產(chǎn)量分別為21.3、16.9、18.4g/L．與野生型菌株CP相比，過表達(dá)PKT，L–亮氨酸的產(chǎn)量略有下降．導(dǎo)入誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒的工程菌CP01生長狀態(tài)與菌株CP基本無差異，導(dǎo)入組成型表達(dá)質(zhì)粒的工程菌CP02則生長顯著下降．工程菌在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，副產(chǎn)物L(fēng)–丙氨酸顯著降低，菌株CP、CP01、CP02的L–丙氨酸產(chǎn)量分別為5.6、5.4、4.1g/L．基于PKT的NOG系統(tǒng)能使菌株攝入的葡萄糖不必經(jīng)過EMP途徑生成AcCoA，而由葡萄糖–6-p生成Ac-P進(jìn)而生成AcCoA，提高了AcCoA的產(chǎn)量，間接減少了前體物丙酮酸的生產(chǎn)，減少了丙酮酸生成副產(chǎn)物的L–丙氨酸的代謝流．

圖4 菌株CP、CP01、CP02的搖瓶發(fā)酵結(jié)果 Fig. 4 Results of flask fermentation of strains CP，CP01 and CP02

2.2 基因組整合PKT對生產(chǎn)L–亮氨酸的影響

當(dāng)胞內(nèi)L–亮氨酸濃度高時(shí)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子LtbR可以抑制leuCD和leuB的表達(dá)[32]．事實(shí)上，研究者在開發(fā)L–亮氨酸生產(chǎn)菌時(shí)均選擇缺失ltbR基因[5,9]. PKT的整合位點(diǎn)選取ltbR．此外，為了減少AcCoA的消耗，將CS的自然啟動(dòng)子替換為弱啟動(dòng)子dapA. 重組質(zhì)粒pK18-ΔltbR、pK18-ΔltbR∷Ptuf-fxpk、pK18-ΔPgltA∷PdapA的菌落PCR鑒定結(jié)果如圖5(a—c)所示．經(jīng)過測序，進(jìn)一步確定質(zhì)粒是否構(gòu)建成功．將重組質(zhì)粒pK18-ΔltbR電轉(zhuǎn)化至C. glutamicumCP，經(jīng)過兩次同源重組，得到工程菌CP03．將重組質(zhì)粒pK18-ΔltbR∷Ptuf-fxpk電轉(zhuǎn)化至CP03，經(jīng)過兩次同源重組，得到工程菌CP04．將重組質(zhì)粒pK18-ΔPgltA∷PdapA電轉(zhuǎn)化至CP04，經(jīng)過兩次同源重組，得到工程菌CP05，菌落PCR鑒定結(jié)果如圖5(d—f)所示．經(jīng)過測序比對，分別與已知序列一致，即得到的工程菌CP03、CP04、CP05構(gòu)建成功．

圖5 重組質(zhì)粒與菌株CP03、CP04、CP05構(gòu)建 Fig. 5 Construction of plasmid and strains CP03，CP04 and CP05

對工程菌CP03、CP04、CP05進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，結(jié)果如圖6所示．

圖6 菌株CP03、CP04、CP05的搖瓶發(fā)酵結(jié)果 Fig. 6 Results of flask fermentation of strains CP03，CP04 and CP05

與工程菌CP03、CP04相比，CS啟動(dòng)子替換為弱啟動(dòng)子后，菌體生物量有一定程度下降，分別為51.1、44.7、41.0．由于PKT的導(dǎo)入C. glutamicumCP基因組，使得工程菌生成AcCoA的能力提升，進(jìn)而提高了以AcCoA為前體物的L–亮氨酸的生成，菌株CP03、CP04、CP05的L–亮氨酸產(chǎn)量分別為21.8、23.4、25.2g/L．此外，NOG系統(tǒng)的引入，分流了一些碳代謝通量，AcCoA的生成減少了對EMP途徑的依賴，EMP的終產(chǎn)物丙氨酸相應(yīng)減少，使得副產(chǎn)物L(fēng)–丙氨酸的生成減少．菌株CP03、CP04、CP05的L–丙氨酸產(chǎn)量分別為5.3、3.6、3.5g/L．

2.3 補(bǔ)料分批發(fā)酵

在5L發(fā)酵罐水平培養(yǎng)出發(fā)菌C. glutamicumCP和工程菌C. glutamicumCP05生產(chǎn)L–亮氨酸，發(fā)酵周期為44h，結(jié)果如圖7所示(*P＜0.05，**P＜0.01)．

圖7 發(fā)酵過程曲線 Fig. 7 Fermentation process curve

整個(gè)發(fā)酵過程，工程菌CP05的生物量低于出發(fā)菌CP，培養(yǎng)至穩(wěn)定期，二者的吸光度分別為165.3、176.1．在發(fā)酵前期，工程菌CP05的L–亮氨酸積累低于出發(fā)菌，是因?yàn)樯锪康陀诔霭l(fā)菌，隨著發(fā)酵持續(xù)進(jìn)行，由于碳代謝流的分布不同，工程菌生產(chǎn)L–亮氨酸的量逐漸高于出發(fā)菌，L–亮氨酸的產(chǎn)量分別為53.0、48.2g/L，二者存在顯著性差異(P＜0.05)．工程菌代謝過程中節(jié)省了碳骨架，使L–亮氨酸糖酸轉(zhuǎn)化率獲得提升，為23.5%，副產(chǎn)物L(fēng)–丙氨酸的質(zhì)量濃度為6.4g/L，較出發(fā)菌下降33.3%(圖8)．

圖8 發(fā)酵液產(chǎn)物HPLC分析 Fig. 8 HPLC analysis of fermentation broth

3 結(jié) 論

通過在L–亮氨酸生產(chǎn)菌內(nèi)，以游離表達(dá)和基因整合兩種方式表達(dá)高活性的突變體PKT，同時(shí)采用“進(jìn)、通、截、堵、出”的策略[33]對相關(guān)基因進(jìn)行代謝工程改造，獲得工程菌株C. glutamicumCP05，經(jīng)過補(bǔ)料分批發(fā)酵驗(yàn)證，能達(dá)到提高L–亮氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，降低副產(chǎn)物生成量的目的．基于PKT的NOG系統(tǒng)引入對以AcCoA為前提物的發(fā)酵產(chǎn)品具有重要作用．