鈣化與非鈣化株系顆石藻Emiliania huxleyi胞內 元素組成對氮限制的響應比較

郭 佳，馮媛媛，侯丹丹，李美琪

(天津科技大學海洋與環境學院，天津 300457)

海洋顆石藻屬于定鞭藻門，是一種可通過生物鈣化作用生產顆石粒的單細胞浮游植物[1]．顆石藻大概貢獻了全球海洋碳酸鈣生產總量的50%[2]，是海洋碳循環的重要組成部分．一方面，顆石藻可通過光合作用吸收大氣中的二氧化碳(CO2)進行有機碳的生產；另一方面，顆石藻通過鈣化作用進行無機碳生產，合成其鈣質化外殼，該過程釋放CO2并改變海水總堿度[3]．顆石藻在除極地及熱帶海域外的全球海洋中廣泛分布，通過衛星遙感圖像可觀測到顆石藻在很多海域中出現大規模季節性水華[2,4-5]，其最具廣布性的優勢物種Emiliania huxleyi是海洋碳循環研究中的模式物種[6]．

顆石藻的各種生理過程，尤其是鈣化作用對海洋酸化的響應尤為敏感[7–10]，但其響應模式存在明顯的種間及株間效應[11]．除海洋酸化外，其生長、光合作用及鈣化作用還會受到溫度、光照強度、營養鹽濃度變化等其他環境因子的影響[12–16]．氮是對海洋浮游植物生長和初級生產起到重要作用的營養元素，是浮游植物細胞內生物大分子的重要組成元素之一，氮限制或缺乏都會影響浮游植物生長與胞內的生理代 謝[17–18]．有研究[19]表明，氮的缺乏會改變藻細胞內物質的組成，如碳水化合物、油脂含量升高，蛋白質含量下降．Berges 等[20]研究表明，在氮限制的條件下威氏海鏈藻(Thalassbsira weissflogii)細胞內由于誘導產生一種蛋白酶會導致大部分蛋白酶的活性也隨之增加，從而使胞內蛋白質含量顯著下降．Han等[21]通過對蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)進行半連續培養發現細胞的脂質含量在氮缺乏的環境中升高．還有部分研究人員研究多種微藻在氮限制條件下的生理指標的變化，他們的研究[22–24]結果表明，氮限制的程度與時間會對不同種系微藻的生物量、生長速率及光合速率產生一定程度的影響；研究還發現在低氮供應時，小新月菱形藻胞內的葉綠素(Chl-a)含量及光合效率均呈現下降趨勢，減緩了藻細胞的生長．氮限制會影響顆石藻光合和鈣化作用中重要功能性蛋白質的生產，硝酸鹽的濃度對顆石藻的生長、光合固碳與鈣化作用起到重要的調節作用[15]，并且可以與海洋酸化對顆石藻的生理過程產生交互效 應[12,25–27]．也有研究[16]表明E. huxleyi在硝酸鹽供應量減少的條件下細胞顆粒無機碳(PIC)含量增加．然而，很少有研究闡明氮限制條件下顆石藻是否存在株間差異，尤其是鈣化和非鈣化株系之間的差異可為我們進一步認識顆石藻的鈣化作用在其生理調節上的意義提供參考信息．在氮限制條件下，我們假設鈣化株系會因為其胞外有鈣質化外殼的保護相較于非鈣化株系的各生理學參數會受到較小的影響．本研究選取顆石藻優勢物種E. huxleyi鈣化株系和非鈣化株系，采用恒化連續培養的方式進行實驗室內受控連續培養實驗，研究兩株系的顆石藻于指數生長期穩態條件下氮限制對其生理指標的影響．該方法與傳統一次性培養實驗方法不同：一次性培養實驗達到的氮限制條件通常是培養基中營養鹽消耗殆盡時，藻細胞進入平臺生長期，瀕臨死亡期，其生長狀態與藻類爆發大規模水華后處于衰退期的狀態相近；而恒化連續培養更好地模擬了自然穩態條件下低硝酸鹽海水中顆石藻的生長狀態．

1 材料與方法

1.1 實驗設置

選取顆石藻E. huxleyi的兩種不同株系，鈣化株系E. huxleyiNIWA1108于2009年分離自新西蘭以東Chatham Rise海域，非鈣化株系E. huxleyiPMLB分離自歐洲北海．兩株藻種均采用f/20自然海水培養基[28](f/2培養基稀釋10倍)并放置于環境溫度為15℃、光照強度為100～120μmol/(m2·s)的恒溫光照培養箱中進行保種培養，光暗周期為12h∶12h．配制培養基所使用的自然海水采自南黃海寡營養鹽海域的表層海水，并使用玻璃纖維濾膜經隔膜真空泵抽濾后用立式自動壓力蒸汽滅菌鍋高溫滅菌(121℃，15min)，以達到無菌的效果，冷卻后備用．

1.2 連續培養實驗

培養實驗采用自制的恒化培養器(包括蠕動泵、裝有攪拌器的培養瓶、排水管等)進行連續培養．對每個株系設置2個營養鹽濃度：(1)氮限制，N/P為1.6(物質的量比)；(2)氮充足，N/P為16(物質的量比)．培養基采用過濾后高溫滅菌的南黃海表層海水，磷酸鹽、微量元素及維生素按照f/20配方添加．硝酸鹽濃度分別添加至N/P＝1.6和N/P＝16水平．將預培養的處于指數生長期的藻液接種到3.5L裝有培養基的培養瓶(聚碳酸酯材質)中，初始細胞密度設定為10000mL－1．在培養箱內采用恒化培養器進行連續培養，將蠕動泵在藻細胞接種后的第3天開啟，開始連續培養實驗．使用蠕動泵將培養基連續泵入培養瓶中，藻液流出口與每個培養瓶的瓶頸處相連接，以保證各培養體系中藻細胞的豐度和體積維持恒定．對于氮充足處理組的蠕動泵稀釋速率設置為0.5d－1，氮限制處理組設置為0.2d－1．實驗過程中為了達到培養瓶中藻液分布均勻的狀態，采用攪拌器(具有特氟龍涂層)在培養瓶中連續低速攪拌．此連續培養實驗在恒溫光照培養箱中進行，光照條件和溫度與保種條件保持一致．每個處理組下均設置3個平行樣．

連續培養開始后，每隔24h取3mL藻液，分成2份：一份用Turner熒光儀測定其活體熒光值；一份用堿性魯格氏試劑(Lugol’s)固定后，放置到XS–213顯微鏡下進行觀察和細胞計數．培養至其指數生長階段并進入穩態超過5d(每個處理組中藻細胞豐度保持相對穩定，變化小于10%)后，進行最終采樣，采樣參數為活體熒光、細胞計數、葉綠素a(Chl-a)含量、沉降速率以及細胞顆粒有機磷(POP)、顆粒有機碳(POC)、顆粒有機氮(PON)含量．本實驗最終培養時間為21d．

1.3 樣品分析

1.3.1 藻細胞計數及Chl-a質量濃度的測定

取1mL藻液于1.5mL的離心管中，并加入6μL堿性魯格試劑(Lugol’s)[29]，放置于黑暗處4℃保存，最后在光學生物顯微鏡下用0.070mL的微藻計數框觀測計數，藻細胞計數所用樣品的保存時間不可以超過1周．

量取50mL藻液經六聯過濾器(隔膜真空泵抽濾壓力小于0.2MPa)過濾到GF/F玻璃纖維膜上．為避免Chl-a見光分解，將濾膜對折后放置于鋁箔紙材質的小袋中，保存于－20℃的冰柜．對樣品進行分析時需在暗處進行，將濾膜置于裝有5mL體積分數90%的丙酮的棕色試劑瓶中，在－20℃環境下暗處理24h后，使用Turner熒光儀的非酸化模式測定其熒光值，根據式(1)[30]計算Chl-a質量濃度(μg/L)．

1.3.2 細胞元素組成的分析

POP含量的測定采用分光光度法[31]．準確量取50mL藻液，經六聯過濾器過濾到馬弗爐灼燒(450℃，4h)過的GF/F玻璃纖維膜上，另取3份等體積的相應背景海水培養基，與上述操作相同，作為空白樣．所取樣品需用2mL 0.17mol/L Na2SO4溶液潤洗經六聯過濾器真空泵抽濾．再將抽濾后的濾膜全部浸入到盛有2mL 0.017mol/L的MgSO4溶液且經馬弗爐灼燒(450℃，4h)過的樣品瓶中，用灼燒過的鋁箔紙輕輕蓋住瓶口，最后將其置于60℃烘箱中，直至烘干．分析樣品前，將裝有濾膜的玻璃瓶置于馬弗爐中，450℃灼燒2h，冷卻到室溫后將5mL 0.2mol/L的鹽酸加入到樣品瓶內，用灼燒過的鋁箔紙封住瓶口置于90℃烘箱中烘烤30min后取出．冷卻到室溫后，將0.5mL顯色劑加入到樣品瓶中，搖勻，顯色10～20min，采用紫外可見分光光度計測定其吸光度，最后根據標準曲線以及過濾體積計算POP含量．

采用CHN元素分析儀對POC和PON含量進行測定[32]．從每個培養瓶中量取2份100mL藻液過濾至預先經馬弗爐灼燒(450℃，4h)過的GF/F膜上，置于60℃的烘箱中烘干．其中一份直接用以測定總顆粒有機碳(TPC)以及PON的含量，另一份采用濃鹽酸熏蒸3h后再次烘干，用于測定顆粒有機碳(POC)的含量．

1.4 沉降速率的計算

把沉降柱垂直固定于支架上，堵住3個出水口，將藻液混勻，倒入沉降柱中，讓藻液充滿整個沉降柱，然后輕輕蓋上蓋子，使沉降柱保持密封(盡量避免產生空隙)，置于同一溫度下避光靜置2～4h．收樣時，從上到下分層依次取樣，記錄所取各層藻液體積，并分別過濾到GF/F玻璃纖維膜上．將濾膜對折，迅速放入疊好的鋁箔小袋內，于－20℃冰箱內保存，用于最后測定其葉綠素含量．浮游植物的沉降速率根據最后測定的葉綠素含量并采用Bienfang的沉降速率公式[33]進行計算．

1.5 統計分析

組間差異檢驗采用t檢驗(SPSS9.5軟件)，P＜0.05時為顯著性差異．文中誤差棒均為標準偏差，n＝3．

2 結果

2.1 胞內Chl-a含量

顆石藻鈣化株系和非鈣化株系的胞內Chl-a含量如圖1所示．

圖1 鈣化株系和非鈣化株系的胞內Chl-a含量 Fig. 1 Cellular Chl-a contents of calcified strain and noncalcified strain

氮限制(稀釋速率0.2d－1)條件下，兩株系的胞內Chl-a含量均較低，非鈣化株系胞內Chl-a含量與鈣化株系胞內Chl-a含量相比降低44.6%．鈣化株系在氮限制的條件下相較于氮充足條件的胞內Chl-a含量下降85.2%；非鈣化株系的胞內Chl-a含量在氮限制的條件下相較于氮充足條件降低89.4%．

2.2 細胞元素組成及比值

顆石藻鈣化株系和非鈣化株系的胞內POC含量如圖2所示．兩個株系的單位細胞內POC含量均受到氮限制的影響．鈣化株系的胞內POC含量在氮限制的條件下相較于氮充足的條件降低21.9%；非鈣化株系的胞內POC含量在氮限制的條件下也相較于氮充足的條件降低33.6%．在氮限制條件下，非鈣化株系的胞內POC含量相比于鈣化株系低37.2%．

圖2 鈣化株系和非鈣化株系的胞內POC含量 Fig. 2 Cellular POC contents of calcified strain and noncalcified strain

顆石藻鈣化株系和非鈣化株系的胞內PON含量如圖3所示．氮限制顯著降低了兩個株系的胞內PON含量．其中鈣化株系的胞內PON含量在氮限制的條件下相較于氮充足條件降低63.1%；非鈣化株系的胞內PON含量在氮限制的條件下相較于氮充足的條件降低62.5%．在氮限制和氮充足條件下，鈣化株系的胞內PON含量均高于非鈣化株系．

圖3 鈣化株系和非鈣化株系的胞內 PON 含量 Fig. 3 Cellular PON contents of calcified strain and noncalcified strain

顆石藻鈣化株系和非鈣化株系的胞內POP含量 如圖4所示．

圖4 鈣化株系和非鈣化株系的胞內POP含量 Fig. 4 Cellular POP content of calcified strain and noncalcified strain

兩個株系的胞內POP含量同樣受到氮限制的顯著影響．鈣化株系的胞內POP含量在氮限制的條件下相較于氮充足條件降低45.0%；非鈣化株系的胞內POP含量在氮限制的條件下相較于氮充足的條件降低75.7%．在氮限制條件下，非鈣化株系胞內POP含量相比于鈣化株系低91.2%．

鈣化株系和非鈣化株系的細胞n(POC)/n(PON)、n(POC)/n(POP)、n(PON)/n(POP)比值見表1．

表1 鈣化株系和非鈣化株系的細胞n(POC)/n(PON)、n(POC)/n(POP)、n(PON)/n(POP)比值 Tab. 1 n(POC)/n(PON)，n(POC)/n(POP)，n(PON)/n(POP)of calcified strain and non-calcified strain

兩株藻細胞的n(POC)/n(PON)在氮限制條件下升高，n(PON)/n(POP)及n(POC)/n(POP)則出現下降．鈣化株系的細胞n(POC)/n(PON)比值在氮限制的條件下相較于氮充足條件升高112.2%；非鈣化株系的細胞n(POC)/n(PON)值在氮限制的條件下相較于氮充足條件升高46%．氮限制條件下，非鈣化株系細胞n(POC)/n(PON)值與鈣化株系相比，下降了27.4%．鈣化株系的細胞n(POC)/n(POP)值在氮限制的條件下相較于氮充足條件下降低35.6%；非鈣化株系的細胞n(POC)/n(POP)值在氮限制的條件下相較于氮充足條件降低24.8%．氮限制條件下，非鈣化株系細胞n(POC)/n(POP)比值相較于鈣化株系降低16.8%；鈣化株系和非鈣化株系兩種株系細胞的n(PON)/n(POP)值在氮限制條件下均明顯低于氮充足處理．與n(POC)/n(PON)、n(POC)/n(POP)不同的是非鈣化株系細胞n(PON)/n(POP)值相比于鈣化株系上升了14.9%．鈣化株系細胞的n(PON)/n(POP)值在氮限制條件下相較于氮充足條件降低71.3%；而非鈣化株系細胞的n(PON)/n(POP)值在氮限制的條件下相較于氮充足條件降低32.9%．

鈣化株系和非鈣化株系的胞內C/Chl-a質量比如圖5所示．在氮限制條件下，兩種株系胞內的m(C)/m(Chl-a)值均顯著高于氮充足條件．其中，鈣化株系的胞內m(C)/m(Chl-a)值在氮限制條件下相較于氮充足條件升高476.9%；非鈣化株系的胞內m(C)/m(Chl-a)值在氮限制下相較于氮充足處理組升高589.1%．與鈣化株系相比，非鈣化株系胞內的m(C)/m(Chl-a)值升高14.3%．

圖5 鈣化株系和非鈣化株系的胞內C/Chl-a質量比 Fig. 5 m(C)/m(Chl-a)of calcified strain and noncalcified strain

2.3 沉降速率

鈣化株系和非鈣化株系的細胞沉降速率如圖6所示．

圖6 鈣化株系和非鈣化株系的細胞沉降速率 Fig. 6 Sinking rates of calcified strain and non-calcified strain

氮限制顯著降低了兩個株系的沉降速率(P＜0.05)．其中鈣化株系的沉降速率在氮限制的條件下相較于氮充足條件降低54.0%；非鈣化株系的沉降速率在氮限制的條件下相較于氮充足的條件降低24.7%．在氮限制和氮充足條件下，鈣化株系的沉降速率均高于非鈣化株系．

根據t檢驗分析結果得出氮限制對鈣化株系與非鈣化株系兩株系細胞的Chl-a含量、PON含量、n(POC)/n(PON)、沉降速率均有顯著性影響，氮限制對非鈣化株系的POP含量、m(C)/m(Chl-a)有顯著性影響．

3 討論

本實驗結果表明，硝酸鹽濃度的變化對顆石藻兩株系的胞內元素組成起到重要的調節作用．與氮充足條件相比，氮限制條件使鈣化株系和非鈣化株系兩株系細胞的Chl-a含量、PON含量及沉降速率均顯著降低[34]．其中，兩株系藻的胞內POP含量受氮限制影響均大于各自的胞內POC含量，其主要原因是藻細胞在生長條件較差的環境下會優先進行固碳作用，從而在氮限制的條件下兩株系藻的胞內POP含量相較于氮充足條件下的變化量大于各自的胞內POC含量．核酸與蛋白質等生物大分子是細胞中重要的生命物質，而氮是合成這些生物大分子的生源要素．與其他營養鹽(如磷限制)相比，氮限制對顆石藻的生長、光合和鈣化速率的影響尤為明顯[15]．這是因為氮限制使得藻細胞中一些作為光合作用重要轉運體的蛋白質會嚴重匱乏[35–36]，細胞在合成核酸與蛋白質等生物大分子過程中受阻，從而導致合成光合色素的能力也減弱，影響藻類細胞的光合固碳能力[37–38]．顆石藻E. huxleyi的鈣化和非鈣化株系對氮限制的響應顯示出了明顯的株間特性．在氮充足條件下，鈣化株系的胞內POC及PON的含量均略高于非鈣化株系．氮限制對非鈣化株系的胞內POC及Chl-a含量的降低幅度均高于對鈣化株系的影響；而對非鈣化株系的胞內PON降低幅度略低于鈣化株系．這意味著氮限制對停止鈣化作用的非鈣化株系的葉綠素合成和固碳速率影響要高于對鈣化株系的影響．相比于對胞內POC合成的削弱，氮限制對兩株系的胞內Chl-a及胞內PON合成抑制作用更大．這導致了兩株系的n(POC)/n(PON)和m(C)/m(Chl-a)比值均在氮限制條件下有較大幅度升高．在氮限制的條件下，兩株系的n(POC)/n(PON)、n(POC)/n(POP)值都分別大于Redfield比值106/16和106/1，鈣化株系的n(POC)/n(PON)、n(POC)/n(POP)值相比于非鈣化株系還要更高一些．其主要原因可能是鈣化株系在氮限制的條件下會優先進行光合固碳生成POC，由于硝酸鹽的匱乏，導致了其蛋白質、核酸等生物大分子的合成受到影響，降低了對營養鹽的吸收與有機氮、有機磷的合成，導致胞內PON、POP含量也隨之降低[39]．

值得注意的是，氮限制顯著降低了兩株系顆石藻的沉降速率，而且對鈣化株系降低幅度顯著高于非鈣化株系．這主要由其對鈣化株系顆石藻的鈣化作用削弱引起的[27]．與其他環境因子相比，氮限制也會通過對鈣化作用相關的功能蛋白合成的影響而顯著降低顆石藻的鈣化速率[15,39]．由于顆石粒的壓重效應是顆石藻向下沉降的主導因素，其鈣化作用的削弱會引起沉降速率的降低．另一方面，浮游植物的有機碳生產也通常會受到氮限制的削弱[40]．這意味著在氮限制的環境中，顆石藻相關的雨率(PIC與POC的質量比)及由顆石粒的壓重效應引起的由表層海洋向深海的碳輸出均會受到顯著削弱[1]．

在預測未來全球氣候變化下的海洋環境中，二氧化碳濃度升高導致的溫室效應會引起冰川融化和降雨模式的改變，從而增強海水分層、改變海洋混合層深度，混合層深度變淺將會削弱從深海向表層海水的營養鹽補充，寡營養鹽海域也會逐漸擴張[1,41]．海洋顆石藻主要生活在混合層以上的表層水體中，很容易受到環境變化的影響，因此，為了更加準確地預測海洋顆石藻在全球氣候變化下海洋顆石藻的生理學響應以及該響應對海洋生物地球化學的反饋，氮限制的研究是其中重要的一環．此外，在全球變化背景下，其他環境因子與氮限制對顆石藻生理過程的交互效應的影響也不容忽視[27–28]．

4 結語

通過對穩定生長條件下的顆石藻E. huxleyi鈣化株系和非鈣化株系進行恒化連續培養，實驗結果顯示：氮限制降低了兩株系顆石藻的胞內Chl-a、細胞顆粒有機氮及顆粒有機碳含量，非鈣化株系胞內各元素含量則相較于鈣化株系降低的幅度更大．氮限制明顯升高了兩株系顆石藻的細胞n(POC)/n(PON)及n(POC)/n(POP)比值，而降低了n(PON)/n(POP)及m(C)/m(Chl-a)比值，相較而言，氮限制對鈣化株系的元素比值影響高于非鈣化株系．兩株系的沉降速率在氮限制下均呈顯著降低趨勢，其中鈣化株系降低幅度遠高于非鈣化株系．氮限制對顆石藻的生理指標有著重要影響，并且存在著較大的株間差異．以上結果有助于我們厘清顆石藻鈣化作用的生理學作用，并為進一步認知和預測在變化的海洋環境中顆石藻這一重要的浮游植物功能群的響應機制及其生物地球化學效應提供了一定的科學依據．