非酒精性脂肪性肝病代謝組學研究進展

欒雨婷， 黃鐘鳴， 沈文娟， 哈明昊， 頊志兵

上海中醫藥大學附屬第七人民醫院 感染性疾病科， 上海 200137

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種與胰島素抵抗(IR)和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝損傷，包括非酒精性單純性肝脂肪變(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化和肝細胞癌(HCC)[1]。隨著飲食和活動方式的改變，肥胖在全球范圍內盛行，全球患病率約25.24%[2]，并呈上升趨勢。在大陸地區，其患病率約29.81%[3]，并已成為我國第一大慢性肝病和健康查體肝酶異常的首要原因[4]。在美國，由NAFLD所產生的NASH也非常普遍，預計到2030年，NAFLD、NASH及其相關HCC病例將分別增長21%、63%和137%[5]。因此，NAFLD是中國乃至世界的衛生問題及經濟負擔。目前其機制并未完全闡明且無特效藥物。針對NAFLD引發的肝纖維化，肝活檢是其金標準，但現實難以廣泛開展。然而越來越多的證據表明NAFLD是一種與代謝紊亂相關的多系統疾病，與2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2MD)、代謝綜合征密切相關。因此，近期國際專家小組達成共識，將其更名為代謝相關脂肪性肝病[6-8]。隨著測序技術的迅猛發展，以基因組學、代謝組學、轉錄組學、蛋白質組學為代表的系統生物學技術提供了新的技術與思路。區別于其他組學技術，以內源性小分子代謝物為研究對象的代謝組學可以很好的揭示機體變化的最終代謝結果。因此，本文就代謝組學技術在NAFLD中的研究進展作如下總結。

1 代謝組學概述

1.1 代謝組學含義 代謝組學最初于1999年由Nicholson等[9]首先提出，是揭示機體受到外界刺激或干擾后內源性代謝產物發生變化與規律的學科。根據代謝產物的理化性質可以分為氨基酸類、肽類、碳水化合物類、能量類、脂類、核苷酸類、維生素和輔助因子類及外源化合物。通過高通量測序，對所測樣本進行定性定量分析，反應機體的代謝產物、途徑和規律。

1.2 代謝組學方法與過程 目前，廣泛應用于代謝組學數據采集的技術平臺有氫/碳核磁共振技術(1H，13C-NMR)、氣相色譜-質譜技術(GC-MS) 、液相色譜-質譜技術(LC-MS)、毛細管電泳-質譜技術(CE-MS)以及直接進樣質譜技術(DIMS)等[10]。LC-MS因其選擇性好、高通量、靈敏度高的特點已成為代謝組學中最常用的平臺[10]。嚴格樣本采集后根據所選擇技術平臺的不同對樣本進行相應的預處理，然后進行代謝物的分離分析、數據處理、生物學功能闡釋等。作為快速發展的新學科，代謝組學較為全面的展示了機體的代謝結果，為臨床醫學提供了新的技術和方法。

2 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)

NAFLD的疾病譜包括NAFL、NASH、肝硬化和HCC。盡管NAFL是一個良性的過程，可以首先通過飲食和運動來改善，但其有發展為NASH和肝硬化并引起T2MD的風險[11]。而在其進展過程中缺乏敏感而特定的臨床診斷生物標志及特效藥。隨著科技的發展，代謝組學為NAFLD研究提供了強大的技術工具。

2.1 代謝組學對NAFLD發病機制研究的推動作用 NAFLD機制尚未完全明確，1998年Day等[12]提出“二次打擊”學說。隨后Tilg等[13-14]提出“多重平行打擊”理論，包括遺傳因素、IR、氧化應激、脂毒性、慢性炎癥、纖維化、免疫和腸道菌群等，系統復雜涉及肝臟、腸道及脂肪組織內的各類細胞及代謝產物。而高通量及高靈敏度特性的代謝組學展示了疾病狀況下的代謝產物及代謝網絡，為闡明NAFLD的發病機制帶來了新的技術手段。Cabré等[15]采用定量靶向代謝組學對因肥胖癥行減肥手術的患者(n=270)和對照組(n=50)進行比較，以期發現肝臟代謝與肥胖之間的關聯性。他們發現NASH患者血漿中α-酮戊二酸和乳酸鹽濃度升高，表明通過谷氨酰胺分解來補充檸檬酸循環可能也是NASH發作的關鍵點。類維生素A是維持肝臟代謝穩態的重要內源性化合物，Zhong等[16]對正常人(n=50)肝臟和NAFLD患者(n=22)肝臟中的維生素A進行了定量代謝組分析。與正常肝臟相比，NAFLD患者肝臟中棕櫚酸視黃酯、活性類視黃醇全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid，atRA)、13-順式維甲酸(13-cisRA)和4-oxo-atRA的濃度顯著降低，而視黃醇水平保持不變。atRA濃度與棕櫚酸視黃酯和13-cisRA呈正相關。他們在人類組織中首次檢測到atRA的活性代謝物4-oxo-atRA，表明這種類維生素A可能有助于人體類維生素A的信號傳導。肝臟維生素A的穩態平衡被打破可能導致疾病進展。為了解不同類型的脂肪酸在推動NAFL向NASH早期發展中的作用，研究人員[17]利用了棕櫚酸(C16∶0)和棕櫚油酸(C16∶1)誘導的脂質過載HepG2細胞模型及穩定同位素標記的脂質組學技術進行試驗。結果表明，C16∶0引起炎癥和細胞死亡，而C16∶1引起大量脂滴積聚。此外，多球殼菌素對鞘脂合成的抑制，加重了C16∶0誘導的脂質凋亡。在C16∶0和C16∶1誘導的兩組細胞模型中脂質譜不同，闡明了特定脂肪酸影響脂質代謝并引起脂質毒性或脂質滴形成。這表明了飽和或單不飽和脂肪酸在肝脂質毒性中起作用，同時多球殼菌素抑制作用通過神經酰胺間接途徑加劇了脂質凋亡。

2.2 代謝組學對NAFLD無創診斷的推動作用 目前用于定義NAFLD的臨床標準多樣(例如肝酶異常、肝臟超聲、肝脂肪指標和肝活檢等)，但多數檢測和方法缺乏敏感性及特異性。超聲對輕度脂肪肝診斷的敏感性、特異性有待提高，且彌漫性肝纖維化和早期肝硬化時也可觀察到脂肪肝的典型特征[18]。盡管患者進展至纖維化進程較慢，但發生纖維化和肝硬化時，NAFLD患者的病死率為16%[19]。而目前“金標準”肝活檢因其有創且有一定并發癥，同時存在取樣及病理診斷誤差等缺陷，未能廣泛開展用于疾病的診斷及動態監測。鑒于近期國際專家小組重新定義的NAFLD不再區分患者有無NASH，無創診斷NAFLD的重點需要聚焦肝纖維化、肝臟炎癥損傷及肝脂肪變程度，從而減少肝活檢的需求[20]。Moolla等[21]對3組受試者(121例NAFLD、48例酒精性肝硬化和106例對照組)進行尿類固醇代謝組分析，發現代謝組學結果可將早期(F0～F2)與晚期(F3～F4)肝纖維化有效分離[受試者工作特征曲線下面積(AUC)=0.92]。此外，對照組分別與NAFLD晚期纖維化(AUC=0.99)和NAFLD肝硬化患者(AUC=1.0)幾乎完全分開。同時NAFLD肝硬化患者與酒精性肝硬化患者也可有效區分開(AUC=0.83)。他們認為此方法可作為區分NAFLD纖維化程度及診斷的無創生物標志物，且可以顯著減少對肝活檢的需求。Mayo等[22]對正常肝臟及NAFL和NASH的受試者血清進行了代謝組學測定，發現了540種脂質和氨基酸，通過邏輯回歸分析在467例NAFLD患者的測試組中確定了2個甘油三酸酯組的診斷模型，可分別用于區分正常肝臟和NAFL以及NASH和NAFL。該診斷模型隨后在192例(7例正常肝臟、109例NAFL和76例NASH)患者的單獨隊列中得到了驗證。Yang等[23]將受試者分為對照組(n=23)、NAFLD組(n=42)、慢性乙型肝炎(CHB)組(n=17)以及同時患有NAFLD、CHB組(n=22)共4組，進行血清脂質組學分析。大多數中性脂質和神經酰胺在同時患有NAFLD、CHB組中升高，在CHB組中降低。三酰基甘油(triacylglycerol，TAG)在NASH患者中增加。血清單不飽和TAG是NASH的重要預測指標，與組織學活性呈正相關(r=0.501，P<0.001)。其在NAFLD組(AUC=0.831)中顯示出對NASH的良好預測性，并在CHB組(AUC=0.833)中得到驗證；單不飽和TAG的增加可能是NAFLD和CHB患者NASH的特異性標志物。

2.3 代謝組學對NAFLD藥物作用與療效研究的推動作用 目前針對NAFLD的藥物包括調控核轉錄因子類、降脂類、胰島素增敏類、平衡代謝類、抗氧化類等[24]。盡管全球發病人數眾多，但目前仍無公認的保肝藥物用于NASH的常規治療，這可能與發病機制中信號通路相互交織靶點眾多有關。因此，藥物作用機制和療效評估顯得十分重要。國內學者[25]采用非靶向脂質組學方法研究參苓白術散(ShenlingBaizhu San，SLBZS)對NAFLD大鼠的保護作用。結果表明SLBZS可有效減輕高脂飲食大鼠NAFLD和異常脂質代謝。其對肝脂質種類的影響主要與甘油磷脂和甘油脂代謝的調節有關。此外，通過Sirtuin 1(SIRT1)選擇性抑制劑EX527抑制肝臟中SIRT的表達，發現SLBZS對肝脂質代謝有益作用的潛在機制可能與肝臟中的SIRT1激活有關。在一項槲皮素對NAFLD大鼠作用機制的研究中[26]，研究者通過喂食高脂蔗糖飲食30 d和50 d來建立2組NAFLD大鼠模型。結果表明，在高脂蔗糖飲食30 d模型組中，槲皮素通過調節脂肪酸相關代謝產物(腎上腺酸等)、炎癥相關代謝產物(花生四烯酸等)、氧化應激相關代謝產物(2-羥基丁酸)和其他差異代謝物(檸檬酸等)來改善NAFLD。而在50 d模型組中并未改善，表明槲皮素可能通過相關代謝途徑改善早期NAFLD，但無法逆轉長期高脂飲食引起的炎癥反應。這種將代謝組學與實驗方法相結合的方式，為研究藥物治療復雜疾病的作用和機制提供了途徑。國外研究人員[27]利用胰高血糖素樣肽1受體激動劑艾塞那肽(Exe)治療NASH模型小鼠，發現Exe改善了與IR和脂毒性相關的脂質組學特性，減少了肝脂質副產物(二酰基甘油、神經酰胺)，降低了肝脂肪形成基因(Srebp1C，Cd36)、炎癥和纖維化相關基因(Tnfa，Timp1)的表達。此類研究可能對NASH患者中胰高血糖素樣肽1受體激動劑的潛在作用機制具有重要的臨床意義。一項基于ω-3脂肪酸二十二碳六烯酸的復合維生素治療小兒NASH的研究[28]發現，經過飲食和微量營養素療法治療后患者臨床及生化指標得到改善。值得注意的是，他們首次報道了小兒NASH治療前后血漿中ω-6/ω-3脂肪酸比例變化，可用于監測患者的預后。

3 小結

盡管代謝組學已廣泛運用于NAFLD的研究，且在各個方面均已取得一定的研究進展。但迄今為止，僅一種生物標志物還不能無創鑒別出患有NASH和輕度至中度纖維化的患者。多種脂質及代謝物的改變參與了NAFLD的發生發展，但現有結果仍存在一定程度的差異，可能與研究取樣標本的標準化[29]、儀器分析和數據處理、分析技術[30]等有關。同時，組學技術的高通量和高靈敏度對樣本的預處理[31]和數據分析方法標準化[32]也提出了更多的要求。

同時，單一的代謝組學只能從代謝角度對NAFLD進行研究，而NAFLD是多種因素共同作用的一類疾病。盡管還未能將NAFLD的不同階段和NASH的嚴重程度準確區分開，有研究者們正試圖將代謝組學與蛋白組學[33-34]、基因組學[35]等進行多組學結合[36]研究，以期多途徑多角度確定發病的確切靶點。在未來的臨床試驗中，可能需要多指標聯合診斷來提高檢驗效能[37]。加強多組學技術在NAFLD領域的臨床試驗，不僅能夠加深對NAFLD發生機制、疾病歸轉與預后的理解。同時實現組學技術的臨床轉化，將NAFLD的無創診斷推廣至社區，構建“家庭-社區-醫院”分層全程管理模式[38]，從而減少肝活檢需求。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：欒雨婷負責撰寫修改論文；黃鐘鳴、沈文娟、哈明昊負責參與文獻的收集、整理；頊志兵負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。