淋巴細胞活化基因3在肝臟相關疾病中的研究進展

陳 銳， 王志鑫， 樊海寧， 王海久

青海大學附屬醫院 肝膽胰外科， 青海省包蟲病重點實驗室， 西寧 810001

在過去的數十年中，免疫療法獲得飛速發展，在傳染性疾病與晚期惡性腫瘤的治療中取得巨大突破。在這些療法中，免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICIs)療法被認作是最有前途也是當前研究最為深入的療法之一[1-2]。目前，基于細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)與程序性死亡受體1(PD-1)/程序性死亡配體1(PD-L1)靶點的抑制劑已實現由實驗室到較大規模臨床應用的轉變。然而，在應用過程中卻暴露出一系列問題：部分患者雖有PD-1/PD-L1和/或CTLA-4的陽性表達，卻對藥物無應答，更有甚者，出現病情超進展(hyperprogressive disease，HPD)，病情迅速惡化；越來越多早期對治療有反應的患者最終結局為病情進展，表現為原發性或繼發性耐藥；患者總體的應答率與設想存在較大差距，治療結果尚不能令人滿意[3-5]。研究[6]發現，治療過程額外的檢查點分子上調是產生低應答率與耐藥性的重要機制之一。因此，尋找額外的免疫檢查點克服當前存在的問題引發學界關注。據報道，目前已發現多種新型靶點，如淋巴細胞活化基因-3(lymphocyte-activation gene 3，LAG-3)[7]、淋巴細胞衰減子[8]以及唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素15[9]等。其中LAG-3作為潛在靶點在機體免疫中發揮了重要作用而引發廣泛關注[7]。肝臟是機體重要的消化器官，其獨特的免疫環境及血流供應成為病毒、腫瘤、自身抗體以及寄生蟲主要侵犯的靶器官，相關疾病嚴重威脅患者生命健康安全。因此探索LAG-3在肝臟相關疾病中的作用成為當下研究熱點。目前關于LAG-3參與肝臟相關疾病的發生發展缺乏系統認識，本文就LAG-3在肝臟相關疾病中的研究進展進行綜述。

1 生物學特性

1.1 LAG-3的結構 LAG-3，又稱CD223，最早由Triebel等[10]發現，是免疫球蛋白超家族成員的一種膜蛋白。分子量為70 kD，定位于人12 號染色體短臂末端(12p13.3)。在發現之初也將LAG-3定義為CD4樣(CD4-like)的膜蛋白[11-12]。LAG-3 編碼基因包含8個外顯子，其對應的cDNA 編碼一類含有498個氨基酸的Ⅰ型穿膜蛋白，該膜蛋白由胞外區、穿膜區和胞內區三部分組成。胞外區由4個免疫球蛋白超家族(IgSF)結構域 D1、D2、D3 和 D4 組成。D1屬于V系免疫球蛋白超家族,而D2、D3和D4屬于C2系免疫球蛋白超家族。其中D1與D3、D2與D4之間具有高度同源性,推斷可能是由2個IgSF區域基因復制而成的4個區域。在D1區有一個由30個氨基酸組成的具有特異性的環狀結構，還含有一個異常的鏈內“二硫橋”。LAG-3的胞質區由3個特殊的蛋白質基序組成，分別是：保守的KIEELE基序； 絲氨酸磷酸化位點S454；重復的谷氨酸-脯氨酸序列。其中 KIEELE 基序是在其他蛋白質中均未出現過的高度保守序列，參與LAG-3分子胞內信號轉導，缺少此段基序將不能對T淋巴細胞產生抑制作用[13-14]。在跨膜基質金屬蛋白酶類AMAD10/17的介導下，成熟的LAG-3分子可將D4 跨膜結構域中的一段連接肽在細胞膜上斷裂為相對分子質量為54 kD可溶性部分(p54)以及16 kD的肽段(p16)，從而維持細胞膜上LAG-3表達的相對平衡[15-16]。

1.2 LAG-3的表達及配體 LAG-3在人體表達局限于有炎癥的扁桃體、淋巴結或濾泡狀增生組織單個核細胞的亞群中[15-16]。最近研究[17-19]發現，在多種實體瘤的腫瘤浸潤淋巴細胞中，LAG-3也呈現高表達。LAG-3作為表達在淋巴細胞表面一種抑制分子，在維持內環境穩定方面起特定作用。主要組織相容性復合體-Ⅱ(MHC-Ⅱ)是第一個被發現也是比較受認可的LAG-3配體，靶向抑制MHC-Ⅱ有助于T淋巴細胞激活。但其是否單獨負責LAG-3的免疫抑制功能存在較大爭議。目前已發現LAG-3的多種替代配體，如半乳糖凝集素-3，肝竇內皮細胞凝集素和α-突觸核蛋白纖維，可以解釋LAG-3無需MHC-Ⅱ的參與而對各種類型的淋巴細胞起到抑制作用。在最近研究中，Wang等[20]發現并證實纖維蛋白原樣蛋白1(FGL1)是 LAG-3發揮T淋巴細胞抑制功能的主要配體，進而提出了新的腫瘤免疫逃逸通路FGL1-LAG-3，對發展下一代腫瘤免疫療法具有重要意義。

1.3 LAG-3的抑制機制 LAG-3的胞質區缺乏典型的抑制基序。抑制信號可能通過胞質區特殊的蛋白質基序(如FsaL基序)進行轉導。Maeda等[21]認為，LAG-3的抑制功能與其在細胞表面的表達水平密切相關，氨基酸的取代和缺失會實質性影響LAG-3的表達水平。Workman等[22]發現KIEELE基序的賴氨酸殘基在介導LAG-3發揮抑制作用中起關鍵作用，但其機制有待進一步研究。研究表明FsaL基序中的苯丙氨酸和亮氨酸被丙氨酸取代會顯著降低LAG-3的抑制能力。此外，當同時存在FsaL序列發生突變與重復的谷氨酸-脯氨酸基序缺失時，LAG-3的抑制能力完全喪失。但僅谷氨酸-脯氨酸重復基序的缺失并不影響LAG-3的抑制能力。說明LAG-3可能轉導FsaL基序和谷氨酸-脯氨酸重復基序兩個獨立的抑制信號，但傳導信號的分子機制仍然未知[21]。

2 LAG-3與肝臟相關疾病

2.1 LAG-3與乙型肝炎 免疫檢查點療法應用于慢性病毒感染性疾病已成為當下研究的熱點。LAG-3作為潛在的靶點引起研究者關注。Ye等[23]通過檢測80例慢性乙型肝炎(CHB)患者、10例慢性無癥狀HBV攜帶者(ASCs)以及18例正常健康人(HCs)外周血中CD8+T淋巴細胞表達的LAG-3發現，CHB組顯著高于ASCs組與HCs組。作為反映CD8+T淋巴細胞功能的標志物IFNγ在CHB組分泌顯著降低。給予阻斷劑后可部分恢復受損CD8+T淋巴細胞功能，與單獨使用PD-L1抗體相比，聯合使用LAG-3和PD-L1抗體可更有效的恢復其功能。在HBV的感染和清除期間，CD4+T淋巴細胞在調節CD8+T淋巴細胞參與免疫應答的過程中起關鍵作用。 Dong等[24]對比了CHB組與HCs組外周血中CD4+T淋巴細胞LAG-3的分布情況，發現CHB組中LAG-3出現顯著升高。與此同時，高表達LAG-3的CD4+T淋巴細胞分泌的IFNγ、IL-2和TNFα明顯減少，阻斷LAG-3后，CD4+T淋巴細胞功能部分恢復。除此之外，LAG-3還可以影響調節性T淋巴細胞(Treg)的表達，介導其分泌抑制性細胞因子抑制CD4+和CD8+T淋巴細胞的激活和增殖。研究[23]發現，PD-1和LAG-3的表達與HBV DNA滴度無明顯關系，與血清ALT水平呈正相關，提示與肝損傷程度相關。目前對慢性HBV的治療尚停留在抗病毒治療的階段。由于肝細胞核內ccc DNA存在，絕大多數患者需終生服藥，不能達到徹底治愈。聯合應用抗體阻斷LAG-3與PD-1介導的T淋巴細胞免疫耐受狀態，從而促進特異性免疫應答的恢復，將成為治療慢性HBV感染新策略。

2.2 LAG-3與丙型肝炎 HCV起病隱匿且病情進展緩慢,目前尚無有效的疫苗可供使用。肝硬化和HCC是慢性HCV感染者的主要死因[25]。研究發現，在慢性HCV感染過程中，肝組織及外周血中HCV特異性CD8+與CD4+T淋巴細胞均高表達LAG-3，表現出功能性耗竭[26-27]。但也有研究[28]發現，無論是HCV抗體陽性還是陰性的患者，肝內和外周CD8+T淋巴細胞中LAG-3的表達沒有顯著差異。由于相關研究均未將病毒載量的數據納入，研究結果差異的原因有待進一步探討[28]。此外研究[29-30]發現，LAG-3還可通過調節Treg細胞與1型調節性T淋巴細胞功能致使HCV持續感染及復發。最近研究表明，LAG-3還參與HCV體液免疫調節。HCV感染過程中LAG-3+CD4+T淋巴細胞增多并表現出Treg樣表型。LAG-3+CD4+T淋巴細胞的頻率與CXCR3+循環濾泡性輔助性T淋巴細胞負相關。在HCV感染期間，LAG-3可能充當負向調節劑，參與中和抗體反應的調節，在介導體液免疫調節中起重要作用。這與阻斷PD-1和LAG-3顯著增強小鼠惡性瘧原蟲感染期間抗體反應的報道[18]相一致。但是LAG-3+CD4+T淋巴細胞是否作為Treg調節循環濾泡性輔助性T淋巴細胞應答仍有待確定[31]。這一發現將有助于進一步了解HCV的持續性感染機制，并通過這些免疫紊亂現象改善疫苗接種方案，達到病毒根治的目的。

2.3 LAG-3與肝細胞癌(HCC) 近年來以PD-1、CTLA-4免疫檢查點為靶點的新型藥物已成為治療晚期HCC的二線藥物[32]。在我國，70%～90%的HCC與HBV感染有關，HBV抗原被認為是HCC的腫瘤相關抗原[33]。Wang等[34]對比了CHB與HCC患者CD8+T淋巴細胞表型與功能狀態，發現HCC組織中CD8+T淋巴細胞表達的LAG-3、PD-1等耗竭標志物水平更高，細胞增殖水平與活性也明顯低于CHB。分析發現兩者在表型、功能狀態和潛在機制有所不同，推測可能是由不同的途徑驅動，其機制不明有待進一步研究。Guo等[35]檢測了143例HCC患者腫瘤組織及腫瘤旁正常組織中LAG-3、FGL1、PD-L1與CD8+T淋巴細胞分布及表達情況，發現腫瘤組織中LAG-3和FGL1的表達水平明顯高于正常組織，而PD-L1和CD8低于鄰近正常肝組織。高水平的FGL1與高密度的LAG-3+細胞密切相關，與PD-L1無關。CD8+T淋巴細胞密度與PD-L1水平呈正相關，與FGL1表達呈負相關。高水平的LAG-3+細胞往往代表患者預后不佳。研究者通過體外分離并擴增單純HCC患者與HCC合并尿毒癥患者外周血中CD8+T淋巴細胞發現后者LAG-3+CD8+、PD-1+CD8+T淋巴細胞等腫瘤反應性細胞比例明顯低于前者，說明HCC合并尿毒癥患者的抗腫瘤能力低于單純HCC患者，HCC合并尿毒癥患者外周血單個核細胞中獲得的腫瘤反應性細胞不適用于T淋巴細胞治療[36]。研究表明，LAG-3與PD-1/PD-L1具有協同作用。HCC組織中絕大多數PD-1染色陽性的腫瘤浸潤淋巴細胞LAG-3表達也增加，但也有研究發現少部分病例只有LAG-3單個靶點表達上調，推測部分HCC患者可能受益于LAG-3通路的抑制，而非PD-1通路，LAG-3免疫檢查點會限制單藥阻斷HCC靶點的功效[35]。針對LAG-3在HCC治療中的應用已引起關注。Wang等[37]發現氧化槐果堿可通過下調IL-6介導的JAK2/STAT3信號轉導途徑降低FGL1的表達進而增敏LAG-3拮抗劑介導的體內外CD8+T淋巴細胞抗HCC細胞(Hepa1-6 和 HepG2)的作用，為聯合使用LAG-3拮抗劑治療HCC提供了潛在證據。最近研究[38]發現，雙特異性抗體MGD013和FS118可與小鼠腫瘤模型中的LAG-3和PD-L1同時結合，阻斷其介導的免疫抑制進而增強機體抗腫瘤能力，此發現為下一代檢查點抑制劑的研制提供新的方向。LAG-3為HCC的免疫治療提供了新思路，對于PD-1/PD-L1抗體產生耐藥的患者將于LAG-3抗體或LAG-3抗體與PD-1/PD-L1抗體的聯合應用中獲益。

2.4 LAG-3與自身免疫性肝病(ALD) ALD是一類由自身免疫介導的肝損傷，與基因易感性、異常的免疫調節網絡以及分子模擬有關。目前尚未明確自身免疫環境發生異常的機制，初步考慮與自身免疫耐受的機制被破壞有關。傳統觀點認為體內免疫環境的穩態及自身免疫性反應的發生與Treg的數量及功能有密切關系[39]。研究者通過檢測ALD患者體內Treg細胞發現其表達的LAG-3與TIM-3數量較正常人明顯減少，同時介導Treg數量減少，限制其發揮免疫調節作用[40-41]。目前證據表明，LAG-3在自身性免疫性疾病的發生發展中起重要作用。研究[42]發現，LAG-3或PD-1單個檢查點缺失的小鼠會出現自身免疫反應，但程度相對較輕。而同時敲除LAG-3與PD-1的小鼠卻表現出較為嚴重的全身性自身免疫反應，說明抑制性免疫檢查點丟失或抑制會促進自身免疫性疾病的發生與發展。據報道[43]，部分接受ICIs療法的晚期腫瘤患者也會出現自身免疫性反應，也從側面驗證了上述結論。此外研究發現，ALD患者外周血中T淋巴細胞表達的LAG-3[44]與PD-1[45]代償性升高，推測與肝組織炎癥活動相關，但其引發的免疫下調作用遠不能抗衡疾病的發生發展，是抑制性信號“相對缺失”的表現。目前，針對ALD的治療尚處在初期階段，激素聯合免疫抑制劑仍是首選的治療方案，但嚴重的副反應限制了患者的受益時間，亟待新型藥物的研發?；贚AG-3、PD-1、TIM-3等靶點的激動劑單獨或聯合應用有望恢復機體免疫耐受狀態，抑制自身免疫反應，達到控制ALD病情進展的目的。

2.5 LAG-3與非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) NAFLD作為一種多系統受累的代謝性疾病，與代謝綜合征以及2型糖尿病互為因果，共同促進肝硬化、HCC以及結直腸腫瘤等肝外臟器腫瘤的發生。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)作為NAFLD疾病譜中重要的疾病，因其致病機制復雜且具有高度向肝纖維化與HCC轉變的風險已成為肝移植的主要原因之一[46]。NASH是目前少數沒有任何標準療法的常見病之一。研究[47]發現，患有NASH的小鼠疾病進展過程中常伴隨內源性IgA+細胞的積聚，IgA+細胞表達的PD-L1可直接與CD8+T淋巴細胞上相關受體結合抑制其功能進而加速向HCC的發展，給予PD-L1阻斷劑后CD8+T淋巴細胞被激活進而誘導HCC消退。同期試驗中研究者注意到，先天性缺乏CD8+T淋巴細胞的NASH小鼠出現腫瘤生長，缺乏IgA+細胞但保留CD8+T淋巴細胞NASH小鼠幾乎均未出現腫瘤生長。研究[47]認為，NAFLD等慢性肝炎可通過抑制體內CD8+T淋巴細胞功能進而加速向HCC轉變。已有多項試驗發現,慢性肝炎疾病中LAG-3表達水平明顯升高，抑制了CD8+T淋巴細胞的功能，這可能是慢性肝炎進展為HCC的重要原因。目前相關研究相對較少，有理由相信基于LAG-3的檢查點抑制劑可延緩NASH向HCC的病程進展，有望成為NASH治療中的新策略。

2.6 LAG-3與肝多房棘球蚴病(hepatic alveolar echinococcosis, HAE) 棘球蚴病根據感染棘球絳蟲的種類不同可分為細粒棘球蚴病(cystic echinococcosis，CE)與多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis，AE)。其中AE的致病性、致殘率和致死率均高于CE，又因其感染人體后的生物學行為與惡性腫瘤類似，故有“蟲癌”之稱[48]。依賴于多種免疫逃避機制，多房棘球絳蟲可在宿主體內長期生存?；颊咴缙诙酂o明顯臨床癥狀，多數就診時已進入病程晚期，失去手術機會。研究[49]發現，HAE患者外周血清中LAG-3、PD-1、TIM-3及其他免疫耗竭標志物較正常人明顯增高，病灶旁肝組織的表達水平顯著高于遠處正常肝組織，提示T淋巴細胞耗竭。Bellanger等[50]使用多房棘球蚴囊液對22例健康志愿者全血中的單個核細胞及自然殺傷細胞進行刺激，發現細胞膜表面LAG-3、PD-1、CTLA-4的表達增加，說明多房棘球絳蟲的免疫逃逸可涉及多個免疫檢查點的調控，負向免疫調節是多房棘球絳蟲持續感染的重要原因。目前尚未有根治HAE的特效藥物，根治性手術仍是首選的治療方案。根據專家共識[48]推薦，根治性切除或肝移植患者術后需至少服用2年以上的阿苯達唑預防復發。目前尚未有相關的預后數據對其預防復發的效果進行評價。據報道，部分患者即使術后規律服用藥物預防，仍會出現復發的現象，目前機制尚未明確，還需進一步研究[51]。隨著對棘球蚴病免疫逃逸認識的不斷深入，免疫檢查點療法應用于術前降期及預防術后復發將成為下一階段研究的熱點。

3 小結

綜上所述，LAG-3 是一類表達于活化的淋巴細胞以及腫瘤浸潤細胞表面的抑制性分子，參與效應T淋巴細胞、調節T淋巴細胞等細胞的增殖與活化，與HBV、HCV、HCC、ALD、NAFLD、HAE的免疫逃逸、免疫失衡密切相關。LAG-3常與PD-1/PD-L1共表達，單獨或與其他檢查點抑制劑協同應用有望克服藥物低反應率及耐藥性的問題，擺脫免疫抑制，提高機體免疫能力。但是，在LAG-3的研究中尚有不少問題亟待解決。首先，LAG-3負向調節T淋巴細胞功能的分子機制尚未明確，是否還存在其他潛在配體限制抑制劑發揮作用；其次，尚不清楚不同類型抑制劑發揮協同作用的分子機制，最佳的抑制劑組合尚未確定；再次，目前只有少量的LAG-3抑制劑進入臨床試驗尚未獲得大規模的臨床應用，缺乏足夠的預后數據對其效果進行評價；最后，當前抑制劑價格普遍昂貴，能否通過優化抑制劑的分子結構降低生產成本從而減輕患者經濟負擔?？傊?，LAG-3有望成為下一代ICIs療法的經典靶點，在調節機體淋巴細胞免疫反應、治療肝臟相關疾病及評估患者預后方面發揮重要的作用。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：陳銳負責擬定寫作思路，撰寫論文；王志鑫負責資料收集及分析，修改論文；樊海寧、王海久指導撰寫文章并最后定稿。