叉頭轉錄因子家族在肝細胞癌中的作用機制及其作為治療靶點的前景

李恬雨， 閆會敏,2

1 河北醫科大學 公共衛生學院流行病與衛生統計學教研室， 石家莊 050017；2 石家莊市第五醫院研究所， 石家莊 050021

肝細胞癌(HCC)是全球第三大最常見的癌癥死亡原因，盡管治療手段越來越多，但療效仍不理想。因此，迫切需要更好地闡明肝癌的分子機制及新的關鍵靶點。叉頭框(forkhead box,FOX)轉錄因子家族是一組結構高度保守的轉錄因子，在控制細胞周期、上皮分化和代謝，以及調節免疫系統等許多生物學過程中發揮重要作用。FOX家族包括19個亞族(FOXA～FOXS)約50個成員，具有翼狀螺旋DNA結合結構域或稱叉頭結構域，這種結構域具有轉錄激活和抑制作用，使FOX具有腫瘤抑制和潛在致癌的雙重作用。本文對目前研究較多的FOXA、FOXC、FOXM1、FOXO和FOXP作一綜述，探討FOX在HCC中的作用機制，以期為HCC的預防與治療提供幫助。

1 FOX家族在HCC發生發展中的作用

1.1 FOXA FOXA又稱肝細胞核因子3(hepatocyte nuclear factor 3,HNF3)，由FOXA1、2、3亞型組成。FOXA1在肝癌中起著致癌基因的作用，在HCC細胞中高表達，可促進HCC細胞增殖與轉移；臨床研究[1]表明，FOXA1在肝癌中表達增高預示著患者預后不良。FOXA1表達失調的機制尚不清楚，近年在非編碼RNA對轉錄因子的調控作用方面備受關注。Wang等[2]發現長鏈非編碼RNA(lncRNA)MCM3AP-AS1可通過直接與miR-194-5p結合并使其充當競爭性內源RNA，調控FOXA1在HCC細胞中的表達。Yuan等[1]發現FOXA1是miR-212-3p的靶點，在HCC細胞中上調miR-212-3p表達，可引起FOXA1表達下降，反之則引起FOXA1表達升高，熒光素酶報告實驗進一步證實二者能夠相互作用。上述研究提示，鑒定靶向FOXA1的非編碼RNA，驗證研究二者的調控關系及其在HCC中的作用，將為HCC的防治提供新思路。

與FOXA1相反，FOXA2被認為是抑癌基因。在HCC組織中，FOXA2表達明顯低于癌旁組織，在HCC中敲減FOXA2表達則會促進細胞增殖[3]。動物實驗[4]顯示，增高FOXA2表達會降低小鼠腫瘤數量和腫瘤負荷。已有幾項研究探討了FOXA2抑制HCC的機制，Liu等[3]發現FOXA1可與人沉默調節蛋白6協同作用，通過抑制轉錄因子鋅指蛋白2而降低HCC細胞的上皮-間質轉化(EMT)過程。Liang等[5]揭示了FOXA2與lncRNA-NEF間的正反饋調節回路，發現lncRNA-NEF被FOXA2激活后，與β-catenin相互作用，通過促進β-catenin與糖原合成酶激酶-3β結合而引起β-catenin的抑制性磷酸化, 這些反應又進一步使FOXA2表達上調，如此形成一個正反饋環，在抑制HCC細胞遷移和EMT中發揮作用。HCC的性二態現象表現可能與FOXA及其靶標有關，FOXA1/2依賴性雌激素受體α介導的雌激素信號傳導抑制HCC的生長，而雄激素受體介導的雄激素信號傳導促進了HCC的生長[6]。

目前關于FOXA3的研究較少。兩項研究[7-8]報道了FOXA3與HNF1A、HNF4A的聯合作用，發現將這3個因子聯合轉染至HCC細胞，不僅能夠更穩定地抑制HCC細胞增殖和腫瘤形成，還可使HCC細胞喪失惡性特征，向類肝細胞發生轉化，這些類肝細胞能夠行使肝細胞功能，重新構建肝板和肝小葉，這一結果為HCC治療提供了新思路。

1.2 FOXC FOXC亞家族包括FOXC1和FOXC2兩個成員，二者在血管形成中發揮著重要作用，提示可能參與腫瘤的發生和轉移。Xia等[9]分析了406例HCC患者腫瘤組織和癌旁組織中FOXC1的表達，證實其表達水平在癌組織明顯高于癌旁組織、轉移病灶明顯高于原發病灶，且FOXC1表達越高，患者生存時間越短。在HCC細胞中上調FOXC1表達，可促進EMT過程和微血管侵犯。同時，也有研究[10]發現，FOXC能夠通過誘導趨化因子(C-X-C基序)受體2和趨化因子(C-C基序)配體2反式激活，促進HCC的侵襲和轉移。FOXC1表達受多個因子的調控，Huang等[10]發現IL-8刺激HCC細胞后，可通過調節PI3K/Akt/HIF-α炎癥信號通路促進FOXC1表達；相反，轉錄因子CCAAT增強子結合蛋白α可通過直接結合至FOXC1啟動子而下調其表達。與FOXC1相似， FOXC2在HCC組織中高表達，且與腫瘤分化程度、AFP水平和不良預后等有關，進一步分析FOXC2表達與EMT相關標志物的關系，發現其與鈣黏蛋白和波形蛋白表達呈正相關[11]。基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9為腫瘤血管生長和轉移的重要參與者，推測FOXC2發揮促HCC作用與Akt介導的MMP-2和MMP-9激活密切相關。

1.3 FOXM1 FOXM1為致癌因子，其異常高表達密切聯系著腫瘤進展。一項包含了14項研究、2036例HCC患者的Meta分析[12]發現， FOXM1表達水平與HCC發生率、腫瘤大小、血管浸潤、分化和TNM分期相關，且FOXM1高表達患者總生存率和無復發生存率明顯降低。在HCC小鼠模型中，FOXM1缺失可使小鼠腫瘤結節數量明顯減少，腫瘤細胞增殖能力下降、凋亡增加；另外，FOXM1可以激活CD44表達，維持HCC細胞的干細胞特征，因此抑制FOXM1有望消除具有干細胞特征的癌細胞[13]。FOXM1可能是慢性肝炎發展為HCC過程中的重要驅動子，慢性肝炎患者肝組織中FOXM1表達水平高于正常肝組織，通過參與癌癥前的肝損傷和炎癥過程，促進HCC的發生[14]，因此，靶向FOXM1可能有助于減輕肝臟炎癥，促進肝損傷恢復，從而阻斷肝炎向HCC發展。

FOXM1可通過調節多種蛋白促進HCC發生發展，目前已證實的FOXM1靶基因包括FOXA2、蛋氨酸腺苷轉移酶1A(MAT1A)、驅動蛋白4A (KIF4A)、蝸牛同源物1(果蠅)樣1蛋白和耐酒石酸酸性磷酸酶5等。FOXM1能夠抑制G1期FOXA2的表達，FOXM1/FOXA2的水平決定HCC細胞的分化狀態，進而影響HCC進展。Li等[15]發現 FOXM1正向調節核因子-κB，但負向調節MAT1A，三者形成的前饋環路引起HCC加速發生，因此，上調MAT1A表達可通過抑制FOXM1/核因子-κB通路而治療HCC。另外，生物信息學分析均提示FOXM1和KIF4A為與HCC發生相關的關鍵基因，二者表達水平呈正相關，體外實驗證實FOXM1可結合于KIF4A啟動子BS3位點直接促進其基因表達，在HCC細胞中過表達FOXM1可增加KIF4A基因和蛋白水平，提示了FOXM1-KIF4A信號軸在HCC發生發展中的重要作用[16]。非洲爪蟾驅動蛋白樣蛋白2靶蛋白(TPX2)充當Hedgehog(Hh)信號通路的新型下游靶標和效應物，Hh信號通過激活FOXM1誘導TPX2轉錄上調，促進G2/M期進展和HCC細胞增殖[17]。

lncRNA在包括HCC在內的許多癌癥中失調，并且在癌細胞增殖、轉移和代謝中起重要作用。最新研究[18]顯示，lncRNA SLC2A1-AS1與信號轉導及轉錄激活因子3的競爭性結合抑制FOXM1的轉錄活性，從而使HCC細胞中的FOXM1/葡萄糖轉運蛋白1 軸失活，進而抑制HCC中的糖酵解和進展。FOXM1作為miR-125a-3p的靶標，lncRNA MALAT1通過miR-125a-3p上調 FOXM1來調節HCC細胞的遷移和侵襲[19]。Wei等[20]研究表明，lncRNA MFI2-AS在HCC中通過充當miR-134的內源性RNA，從而上調FOXM1的表達，促進HCC增殖和轉移，這些研究為靶向FOXM1在HCC中的直接診斷和治療提供了新的思路。

1.4 FOXO FOXO家族包括FOXO1、3、4、6四個成員。FOXO家族可通過促進細胞周期阻滯、活性氧的解毒、受損DNA的修復和凋亡等作用抑制腫瘤細胞增殖；另外，FOXO家族也可誘導死亡受體配體和腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)等多種促凋亡調節因子的表達而促進腫瘤細胞凋亡，因此，FOXO一直以來被認為是抑癌基因。然而，FOXO家族成員的單基因敲除并不能促進腫瘤發生，只有敲除2個以上基因才能導致腫瘤發生增加，反映了FOXO家族作為腫瘤抑制子的冗余調控方式。許多分子通過調控FOXO家族活性影響腫瘤細胞的生物學行為。Shi等[21]發現，HBV蛋白結合蛋白能夠通過激活PI3K/Akt通路和上調miR-135a表達來下調FOXO1活性，進而促進HCC的進展。Jiang等[22]研究證實，FOXO1是NK3同源盒1(NKX3.1)的直接靶標，NKX3.1通過調節FOXO1的表達并誘導G1/S期細胞周期停滯來抑制HCC細胞增殖。miRNA對FOXO家族具有重要調節作用，miR-5188可通過抑制FOXO1表達，激活Wnt/β-catenin通路，促進HCC細胞的腫瘤干細胞特性、轉移和耐藥性[23]。

近年來，FOXO在腫瘤促進中的作用越來越受到關注。Lu等[24]發現FOXO3在HCC患者肝組織中活性明顯增強；動物實驗顯示，FOXO3高活性的小鼠出現大量的肝損傷和HCC相關因子表達升高；在二乙基亞硝胺誘導的HCC模型中，FOXO3高活性小鼠的腫瘤數量明顯增多，提示FOXO3在肝毒素誘導的腫瘤發展中發揮著腫瘤啟動子的作用。Wang等[25]研究發現，由HBx引起的卷曲螺旋結構域50蛋白表達增高，可通過激活Ras/FOXO信號途徑促進HCC生長和轉移。非染色體結構維護凝縮蛋白Ⅰ復合體G亞基參與細胞周期過程中染色體的凝集和分離，在HCC中被認為是癌基因，可通過激活PI3K/Akt/FOXO4途徑促進HCC細胞增殖、抑制凋亡[26]。FOXO6在HCC細胞中高表達，敲低FOXO6可以通過抑制PI3K/Akt信號通路來抑制HCC細胞的糖酵解并降低其對化療的耐藥性，提示FOXO6可能是治療HCC的新靶標[27]。

FOXO家族在癌癥中既可以充當抑癌因子，又可以誘導腫瘤發生，其對HCC是否抑制或激活尚未有定論，對其進行深入研究將會在HCC防治中發揮重要作用。

1.5 FOXP FOXP家族包括FOXP1、2、3、4四個成員，分別調節B淋巴細胞、語言功能、調節性T淋巴細胞(Treg)和T淋巴細胞的發展。FOXP基因家族具有抑癌和促癌雙重生物學作用，FOXP1在HCC中表達增高，下調FOXP1表達可以通過誘導G1/S期細胞周期停滯而抑制HCC細胞增殖[28]。相反，FOXP2在HCC組織中呈低表達，且其表達下調與腫瘤侵襲及總生存期短密切相關[29]。在FOXP家族中研究最充分的是FOXP3，作為調節Treg發育和功能的關鍵分子， FOXP3失調可導致機體免疫失衡。在腫瘤中，FOXP3+Treg通過抑制效應性T淋巴細胞而促進腫瘤細胞發生免疫逃逸[30]。但也有研究[31]提示FOXP3為腫瘤抑制因子。在HCC中，FOXP3可通過增強TGFβ受體Ⅰ的磷酸化和激活TGFβ/Smad2/3信號通路抑制HCC進展。FOXP4為腫瘤促進因子，可促進HCC細胞增殖，并可通過調節EMT相關轉錄因子Slug促進HCC細胞發生EMT[32]。

1.6 其他FOX家族基因 FOXF1和FOXF2在HCC中低表達，過表達FOXF1可以顯著抑制HCC細胞的增值和侵襲能力，并通過降低肝癌細胞的干性和增殖、侵襲能力而在抑制腫瘤進展中起關鍵作用[33]。FOXF2低表達誘導EMT而促進HCC的發生，其表達水平與HCC患者的總生存期和無復發生存率密切相關[34]。而FOXG1為促癌因子，過表達FOXG1可增加HCC細胞的侵襲和轉移能力，直接結合并促進β-catenin核易位，誘導淋巴增強因子/T淋巴細胞因子的轉錄激活并上調許多Wnt/β-catenin信號通路的下游基因，促進HCC細胞的EMT[35]。FOXJ1在HCC中上調，促進腫瘤細胞的增殖和細胞周期的轉變，與組織學分級和預后不良有關[36]。FOXJ2破壞細胞核酸結合蛋白與磷酸葡萄糖突變酶1(PGM1)啟動子的結合以增加PGM1表達，FOXJ2通過增加PGM1表達來抑制腫瘤細胞的糖酵解和增殖，從而調節糖酵解和糖原代謝之間的葡萄糖運輸來抑制HCC的進展[37]。FOXK1的表達在HCC中顯著上調，可促進HCC細胞增殖、遷移和侵襲，上調腫瘤干細胞標志物EpCAM和乙醛脫氫酶1表達從而增強癌細胞干性，與HCC進展呈正相關[38]。FOXK2在HCC中起促癌基因的作用，可通過PI3K/Akt信號通路促進細胞遷移和增殖[39]。FOX基因家族的其他基因在HCC中的作用亟待進一步驗證。

2 FOX家族分子作為HCC潛在治療靶點

FOX家族分子作為轉錄因子可以通過調控靶基因，參與多種細胞生物學過程，在癌癥發生發展中發揮重要作用，因此，FOX家族分子可能是頗具潛力的HCC治療靶點。最近幾項研究已嘗試使用靶向FOX家族的藥物治療HCC。硫鏈絲菌素為包含噻唑結構的抗生素，可特異性抑制FOXM1轉錄活性，誘導HepG2細胞周期阻滯和細胞死亡，降低染色體不穩定性基因CIN25和CIN70，因此利用硫鏈絲菌素定向干預FOXM1對患者可能具有治療價值[40]。鹽屋霉素A在多種癌癥中表現出抑制FOXM1表達，延緩腫瘤生長。FOXM1是具有干細胞樣特征的HCC細胞所必需的，利用鹽屋霉素A抑制FOXM1可有效抑制干細胞樣特征球狀集落的形成[41]。此外，蛋白酶體抑制劑如MG115、MG132或硼替佐米可以抑制FOXM1的轉錄活性和表達，對FOXM1的負調控可能有助于其抗癌特性[42]。蛋白酶抑制劑可以選擇性殺死癌細胞而不影響正常細胞，是有效的抗腫瘤藥物之一。

針對FOXO家族的腫瘤抑制作用，一些研究[43-44]探討能否通過激活FOXO家族HCC。紫花牡荊素和牡荊脂素化合物可通過抑制FOXO3a磷酸化而抑制HCC細胞增殖、促進凋亡，發揮抗腫瘤作用。三氟拉嗪是用于抗精神類疾病的藥物，其在HCC中能夠促進FOXO1易位至細胞核，上調Bax/Bcl-2表達，從而發揮抗腫瘤作用[45]。基于FOXO家族的促腫瘤作用，抑制FOXO家族活性可能有助于HCC治療。AS1842856是一種針對FOXO1小分子抑制劑，可通過干擾FOXO1抑制多種腫瘤，但其在HCC中的作用尚未得到證實。

目前針對FOX家族靶點的藥物研究尚處于探索階段，將其應用于臨床治療還需要大量研究支持。

3 總結與展望

綜上所述，FOX家族作為轉錄因子通過轉錄調控和信號轉導途徑在HCC發生發展中起著重要作用，因此，這些分子有望成為HCC治療的潛在靶基因。但這些分子的調控機制尚未完全闡明，FOX家族分子間是否存在相互作用，以及這種相互作用對HCC進展有何種影響還不清楚，以FOX家族分子為藥物作用靶點的臨床研究還非常罕見。相信隨著研究的不斷深入，以這些分子作為新靶點的治療將會為HCC治療帶來新希望。

利益沖突聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：李恬雨負責資料分析，撰寫及修改論文；閆會敏負責擬定寫作思路，修改論文并最后定稿。