大豆抗病性和分子標記及分子輔助育種研究進展＊

韓英鵬，楊振紅

（東北農業大學大豆研究所/大豆生物學教育部重點實驗室/農業農村部東北大豆生物學與遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150030）

1 大豆分子標記及分子輔助育種研究的重要性

大豆是我國最重要的糧食和油料作物之一，近年來，我國大豆的需求量逐步增加，僅2019年，需求總量就高達10 500萬t，但國產大豆產量僅為1 809萬t，需求缺口高達8 700萬t左右，并有不斷擴大的趨勢。面對進口大豆依賴度越來越高的窘況，合理運用多種育種手段培育優質、高產、多抗大豆新品種，來提高大豆產量和品質，填補產需缺口是大豆育種家們的首要任務[1]。

相較傳統育種手段，分子標記輔助育種具有育種年限短、效率高、準確性強等特點，成為大豆育種研究的熱點[2]。近年來基因組技術的發展和DNA標記逐步整合到大豆遺傳連鎖圖譜中，目前已鑒定出大量與重要性狀相關的QTL，其部分QTL已應用于大豆分子輔助標記育種[3]。王傳之等[4]利用抗病標記對自然群體材料進行基因型鑒定，篩選出符合預期的抗花葉病毒病SC7株系的大豆新品系；葉俊華等[5]利用大豆抗胞囊線蟲病基因和耐鹽基因的5個KASP標記及大豆抗花葉病毒的1個SCAP標記，對1 489份大豆品種的基因型進行了鑒定，篩選出多個抗病耐鹽新種質。李瓊等[6]以周豆25號和周豆18號雜交后自交獲得F2群體為材料，運用BSA方法從144對大豆高蛋白基因SSR分子標記中，鑒定出貢獻率高的satt182并驗證了其在分子輔助選育高蛋白品系中的作用。充分了解與大豆重要性狀相關的QTL及其分子標記，及時掌握大豆分子輔助育種方面的最新動態，對加快大豆育種進程及提高育種準確性十分有利。綜述匯總了2021年分子標記及抗病育種的主要進展，對大豆分子標記和抗病育種前景進行展望，期望總結前人的研究成果，為大豆分子輔助育種提供有力工具。

2 國際相關研究動態

對2021年國內外大豆分子標記及分子輔助育種方面的研究報告進行查閱匯總，發現主要集中于抗病、抗逆、產量和品質性狀上，這些研究大多通過連鎖分析、關聯分析及BSA等策略之間的結合，獲得與重要農藝性狀相關的QTL和SNP標記。通過對挖掘的遺傳位點精細定位，將鑒定出與性狀相關的候選基因應用于分子輔助育種中，為驗證基因功能，梳理表達機制提供便利。通過開發與其連鎖的分子標記再利用，能夠改進遺傳圖譜的精度，定位新的性狀相關候選基因。

2.1 國際大豆抗病性狀研究

大豆疫霉根腐病方面，Li等[7]通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補（BIFC）實驗，證明大豆疫霉效應因子Avr1b與E3泛素連接酶GmPUB1的相互作用是被攜帶抗性-b和-k基因大豆識別的前提。大豆菌核病方面，草酸（OA）是核盤菌導致大豆菌核病發生的重要毒力因子，McCaghey等[8]以草酰乙酸乙酰水解酶（Ssoah1）缺失突變體是OA缺陷型且對大豆無致病性為切入點，將靶向Ssoah1的BPMV載體（pBPMV-OA）接種大豆。結果顯示，與空載體對照植物相比，pBPMV-OA接種的植物對核盤菌的抗性增強。大豆胞囊線蟲方面，Kofsky等[9]從野生大豆資源種鑒定出SCN抗性生態型NRS100，同時解析了該生態型通過抑制茉莉酸信號通路，允許水楊酸（SA）信號激活SCN抗性反應，并通過多胺的合成過程促進根細胞壁結構的完整性。Ravelombola等[10]通過全基因組關聯研究（GWAS）和基因組選擇（GS）結合的方法，驗證了大豆耐受指數（TI）對SCN感染的大豆基因型之間存在差異；SMR、GLM（PCA）和MLM（PCA+K）模型分別鑒定到35，21和6個SNP與SCN耐受性相關，其中6個SNP在模型之間重疊，適合精細定位抗SCN候選基因。

2.2 國際大豆抗逆性狀研究

大豆耐澇方面，Sharmin等[11]利用243個品種中獲得的34718個SNP進行GWAS分析，通過混合線性模型（MLM）和多位點隨機SNP效應混合線性模型（mrMLM），分別定位到2個與種子淹水耐受性相關的SNP位點。耐旱方面，Chuong等[12]利用轉基因技術，將大豆GmHP08基因導入擬南芥異源表達。在缺水條件下，與野生型（WT）比較，轉GmHP08基因擬南芥存活率更高，抗氧化酶編碼基因的表達明顯增強。相反，衰老相關基因之一的GmSAG13基因和幾種脫落酸（ABA）相關基因的表達受到抑制。Chamarthi等[13]以6個環境條件下種植的200份不同成熟度組（MG）IV材料和6個檢驗品種為材料，利用34 680個單核苷酸多態性（SNPs）進行關聯作圖，識別出188個與冠層萎蔫（CW）相關的顯著SNP，其附近共鑒定出183個候選基因，其中57個SNP存在于直接或間接地與蒸騰或節水有關的基因中。

2.3 國際大豆產量性狀研究

大豆豆莢種子數方面，Jeong等[14]以Sowon（窄小葉和高豆莢粒數）和V94-5152（寬小葉和低豆莢粒數）的雜交后代BC3F2種群為研究材料，通過高分辨率作圖法劃定到一個66 kb控制窄葉形狀和NSPP（每莢豆莢粒數）性狀的基因組區域，該區域包含3個與豆莢粒數相關的候選基因。百粒重方面，Ravelombola等[15]通過全基因組關聯分析（GWAS）和基因組選擇（GS）方法評估了250個種質和10 259個高質量SNP，鑒定出37個與種子重量相關的SNP，23個與大豆產量相關的SNP。KIX結構域蛋白家族成員在植物中負調控細胞增殖，Nguyen等[16]利用正向遺傳方法和CRISPR/Cas9基因編輯技術使大豆中GmKIX8-1基因不表達，結果發現功能缺失的GmKIX8-1突變體顯著增加了大豆種子的氣生器官。

2.4 國際大豆品質性狀研究

大豆異黃酮含量方面，Knizia等[17]以SNP位點繪制了Williams 82重組自交系（RIL）群體的遺傳連鎖圖譜，NC-2018和IL-2020 2個環境條件下在染色體（Chrs.）2、4、5、6、10、12、15、19 和 20上，共鑒定了27個控制種子異黃酮性狀的QTL，其中Chrs.2、4、5、12、15和19上的6個QTL為新位點，剩余21個QTL已通過GWAS方法得到鑒定。風味方面，大豆籽粒中的脂氧合酶（Lox1，Lox2和Lox3）會使大豆制品產生豆腥味，影響大豆在食品加工中的利用。Carpentieri等[18]利用編碼Lox1，Lox2和Lox3三種酶的遺傳標記分析發現，品種BRS213中存在純合的空等位基因Lx3，與BR36雜交地F2分離群體中鑒定出雜合子雜合和純合Lx3系。另外，通過遺傳標記Satt090和Satt417確認出親本品種BRS 213中存在純合子Lx2空等位基因。此外，Kumar等[19]利用改良標記輔助回交技術，培育出遺傳上不含脂氧合酶-2的基因型NRC132，以期提高大豆在制造食品中的利用率。

3 國內相關研究動態

3.1 國內大豆抗病性狀研究

大豆疫霉根腐病方面，Lin等[20]以易感E13390與抗性E13901雜交獲得的228個F4∶5家系為遺傳定位群體，采用ICIM作圖法定位了qPsan5.1和qP-san16.1 2個QTL位點，2個位點之間產生加性互作作用，應對MPS17-22疫霉菌株的感染。過氧化物酶相關基因GmSPOD編碼蛋白能夠使細胞加快積累活性氧（ROS），破壞細胞膜結構，影響作物的生長，bHLH轉錄因子GmPIB1可以抑制GmSPOD的表達，提高毛狀根對大豆疫霉根腐病的抗性，Liu等[21]利用Co-IP和MS對過表達GmPIB1的轉基因大豆分析，鑒定出392個可能與GmPIB1互作的蛋白，利用熒光素酶互補和酵母雙雜交方法發現只有26S蛋白酶體調節亞基GmSPOD與GmPIB1相互作用；過表達GmSPOD-OE毛狀根中26S蛋白酶體活性顯著高于對照，對大豆疫霉菌的抗性顯著提高；GmSPOD-RNAi毛狀根中26S蛋白酶體活性顯著低于對照，對大豆疫霉菌的敏感性增強，上述結果解釋了大豆26S蛋白酶體調控病原菌反應的重要機制?；ㄈ~病毒方面，Yuan等[22]利用祁黃-1×南農1138-2雜交組合中近等基因系R（RSC3Q）和S（RSC3Q）接種SMV后，發現感染早期SC3介導的抗性中茉莉酸抑制基因（TIFY/JAZ）和脫落酸誘導基因（PP2C3a）在R系上調，表明茉莉酸和脫落酸激素在大豆抗SMV的響應中扮演著角色。相較Yuan[22]等的通路研究，Liu等[23]以表型定位基因的方法，將抗BCMV和SMV的大豆變異品種V94-5152與敏感品種Williams 82雜交的F2接種BCMV分離株HZZB011，定位到一個位于BARCSOYSSR_02_0617下游0.2 cM處的抗BCMV-HZZB011的分子標記，其附近分布有10個候選基因。大豆孢囊線蟲方面，Zhou等[24]從地方品種PI567516C中鑒定的QTL位點qSCN10被證實對多種SCN有抗性，精細定位到的區域內含有51個候選基因，其中4個與防御相關的基因受SCN侵染的調節。對該位點進行進一步分析時，發現其結構，進化關系以及變異程度均有別于已報道的QTL，田間試驗中，該位點同樣表現出較好的性狀，確定PI567516C作為新穎遺傳抗性大豆資源的可能性。Shi等[25]通過SNP標記及SCN抗性的GWAS分析，在菜豆pv01、03、06、07、09、10和11上同樣檢測到12個與生理小種HG型抗性相關的SNPs。還有Jiang等[26]的研究表明，在大豆孢囊蟲脅迫下，東農L-10（SCN 4抗性品種）和黑農37（SCN 4易感品種）之間差異表達基因數量不同，東農L-10中PR蛋白家族基因GmRSCN4-1（Glyma.05G204800）和細胞色素P450家族基因GmRSCN4-2（Glyma.16G195600）的相對表達水平顯著高于黑農37。

3.2 國內大豆抗逆性狀研究

大豆耐旱方面，Chen等[27]通過酵母雙雜交、免疫共沉淀和雙分子熒光互補技術，發現在干旱脅迫下細胞核中的GmNTF2B-1能夠與氧化還原酶GmOXR17相互作用，促進后者從細胞質轉移至細胞核，增強核內活性氧（ROS）的清除，進而提高大豆抗旱性。耐鹽方面，Xun等[28]通過構建GmADR1基因啟動子的過表達載體，研究發現被轉化大豆植株的耐鹽基因GmCaM4的表達得到增強；與未轉化的野生型相比，轉基因植物具有顯著的耐鹽性。表明通過轉基因手段引入內源啟動子可以驅動大豆特定組織和器官中功能基因的表達。Gm-CIPK是鹽過度敏感（SOS2-like）蛋白，Ketehouli等[29]研究表明在鹽水、干旱或脫落酸（ABA）脅迫GmPKS4表達上調，GmPKS4的過表達增強了轉基因擬南芥和大豆毛根體內活性氧的清除、滲透物的合成和應激相關基因的轉錄調控。耐鋁方面，Wang等[30]首先通過GO和KEGG富集分析，發現未處理組和鋁處理組之間的729個差異表達基因（DEG）主要富集于防御反應、質膜和分子轉導活性途徑。通過加權基因共表達網絡分析維恩圖篩選出的815個DEG，鑒定出未處理組和鋁處理組之間差異最大的5個DEG。

3.3 國內大豆產量性狀研究

大豆莢數方面，Ln是擬南芥JAGGED（JAG）在大豆中的同源基因GmJAGGED1，屬于鋅指蛋白家族，對Ln的近等基因系表型研究發現，NIL-Ln的豆莢一般為3粒莢和2粒莢，NIL-ln系中通常具有較多的4粒莢和3粒莢，說明Ln是莢粒數的相關基因[31]。杜浩等[32]為了將Ln基因應用于低緯度地區大豆育種中，通過開發Ln基因的分子標記，連續回交后將Ln基因代換到圓葉型品種Williams 82和華夏3中，獲得了4粒莢較多的大豆新材料。裂莢方面，豆莢開裂性狀在大豆成熟后期對大豆產量影響較大，有效控制豆莢的開裂，可以防止自然環境和機械因素所造成的減產。Han等[33]首先對黑河43（抗裂型）和黑河18（抗裂型）2個品種子代的落粒率進行遺傳分析，鑒定出黑河43的抗裂性遺傳力高，進一步利用黑河43×黑河18的RIS群體構建的分離群體進行定位分析，發現包含19個基因的qPD05-1位點，此研究為大豆抗裂基因的篩選鑒定提供了可靠的標記。百粒重方面，Zhang等[34]在4環境下133個中國大豆品種的百粒重（100-SW）表型數據，并利用82187個SNPs進行GWAS分析，至少兩壞境中重復檢測到27個SNP，其中有7個是百粒重（100-SW）的大效應標記，通過對標記附近的潛在基因進行qRT-PCR，發現有3個候選基因與百粒重相關性緊密。Zhang等[35]對國內283個大豆種質中獲得的大量高質量SNP及進行GWAS分析，確定了5個與種子重量相關的基因座，其中qHSW-16區域中Soy-ZH13_16G122400鑒定為控制種子重量的新型候選基因。遠月麗[36]對氮高效大豆坡黃、低氮敏感大豆84-70以及雜交后的RILs群體225個子代進行HiSeq測序，構建了高密度遺傳圖譜，結合115個家系4個氮效率相關表型性狀進行QTL定位分析。檢測到16個主效QTLs，均位于11號染色體。qTDW-20位點在正常氮條件和低氮脅迫下同時被檢測到，對定位到的主效QTLs所在區間進行基因功能注釋，預測到16個與轉錄調節、信號傳導、氨基酸合成和能量轉換等性狀相關的候選基因。

3.4 國內大豆品質性狀研究

大豆豆莢顏色方面，Chang等[37]將187份材料組成的大豆關聯組（SAP）與284份RIL材料結合進行全基因組關聯分析，鑒定出豆莢顏色相關位點qPC3和qPC19，分別位于第3和第19染色體，12個莢果大小相關的穩定QTL。在種皮形態方面，Liu等[38]以改良野生大豆染色體片段代換系（SojaCSSLP5）群體為研究材料，利用基因重測序，得到1 366個SNPLDB（SNP連鎖-不平衡塊）的物理圖譜，利用SNPLDB-map，鑒定出2個與種皮顏色連鎖相關的基因座，6個與開花期相關的基因座。此外結合親本RNA-seq和DNA-重測序，對2個SCC和6個DTF候選基因[包括3個已克隆的（G、E2和GmPRR3B）和5個新檢測的]進行了核苷酸突變水平的預測和驗證，發現8個親本等位基因中有6個與303份種質材料相同的等位基因，表明野生品種與栽培品種組合形成的染色體片段代換系可以作為鑒定野生和栽培候選基因等位基因的有效平臺。營養成分方面，主要體現上油分、蛋白和異黃酮含量等物質成分。選取含油量存在差異的大豆品種：合農75（23.40%）、高油大豆品種合豐50（22.57%）以及低油分含量大豆品種抗線蟲4號，采用毛細管電泳技術對合農25個油分相關SSR分子標記進行分析，結果顯示，有21個SSR由母本合豐50遺傳，10個SSR來源于父本抗線蟲4號，油份超親累加性狀的分子標記4個[39]。Sung等[40]利用GC儀測定多環境下621份品種的FAs譜，參照已公開的SoySNP50K基因型數據進行GWAS關聯分析，確定了43個與脂肪酸顯著相關的基因組區域，其中包括9種新的環境特異性FA相關基因組區域。Zhang等[41]同樣利用SoySNP50K基因型數據對211份大豆材料的油分、蛋白質以及水溶性蛋白性狀進行GWAS關聯分析，分別鑒定出3個蛋白質、4個油脂、5個水溶性蛋白質含量相關的QTL，多環境下5個QTL被檢測到，進一步分析發現，各QTL位點處的基因與3種性狀的關系為負相關。這表明通過分子標記所篩選的候選基因，既可表現為促進作用，也能起抑制作用。Li等[42]首先根據（墾豐14×墾豐15）×（河農48×墾豐19）的重組自交系獲得2 232個SNP構建了分子遺傳圖譜，整理10個環境條件下蛋白質和油分表型數據，采用ICIM法進行QTL分析，最終篩選出6個QTN衰減區基因，其中有4個候選基因與大豆蛋白的合成代謝相關。而劉家伶等[43]為了構建脂肪和蛋白含量性狀上存在顯著差異的大豆高密度遺傳圖，首先利用吉農45和綏農76雜交的F2代分離群體獲得SNP標記進行構建，然后結合群體籽粒脂肪和蛋白含量表型數據進行關聯分析和基因注釋，最后篩選到222個與脂肪和蛋白貯藏、油脂生物合成、油分代謝過程、脂肪酸生物合成、種子發育和種子萌發相關的基因。楊紅燕等[44]利用川渝地區主要的232份品種材料在2個環境中的表型數據進行整理，然后結合大豆20條染色體上的SSR標記通過混合線性模型進行GWAS分析，最后篩選出與蛋白質含量顯著關聯的位點有16個，貢獻率與油脂含量相關的位點有19個，貢獻率最高分別為4.02%、4.67%。在異黃酮含量方面，Yang等[45]對來自各國250個地方品種和栽培品種進行重測序，篩選鑒定出3個與異黃酮含量相關的候選基因。

4 發展與建議

大豆是我國主糧作物之一，對穩定糧食安全起著重要作用。由于國內大豆產量低，品質差，自2004年，我國開始從國外進口大豆，截至2021年，進口總量約占國內大豆總需的85%。如何有效且快速地選育出產量高、品質優及抗性強的大豆品種成為難題。隨著信息化的發展，分子生物技術得到廣泛應用，以指導性強、操作簡單、育種年限短等特點成為首選工具，并隨著各種輔助型技術的開發和利用，在分子范疇上，大豆的遺傳機理被普遍研究。分子標記和分子輔助育種手段的應用使大量的大豆抗性相關基因被鑒定，豐富了大豆抗性基因庫。

通過對2021年大豆分子標記的研究和應用的總結，發現分子標記的相關研究逐漸遍及大豆多個性狀，每年通過測序和關聯分析所定位鑒定的基因較多，形成了熱潮。不過分子標記在育種中的應用仍存在著一些問題。首先，遺傳位點的定位易受環境和研究方法等諸多因素的影響，造成結果存在精確度差的問題。其次，基因的重組會破壞與遺傳位點連鎖分子標記。再者，大豆的大多數性是由多基因控制的，分子標記對其的設計還存在難度。最后，分子標記的研究在不斷深入，但應用于實際的卻很少。為了更好地進行基礎研究，新穎定位技術的研發必不可少；設計更加牢固的分子標記也是努力的方向；多組學層面上的聯合是揭示基因功能最為準確的方法；如何將分子標記輔助育種技術從基礎拓展到實際應用需要處理好與傳統育種之間的關系。面對作物種植面積、品種退化以及抗性不顯著等關鍵問題，分子標記輔助育種的應用依然是首選，相信隨著技術的不斷更新，大豆育種工作會更加簡捷，育種成效會更加顯著。