食品黃曲霉毒素總量檢測方法的研究與應用

摘要：在當前新時代背景下，民眾對食品安全問題的重視程度不斷提升，在此背景影響下，我國科研界也加大了對食品安全檢測技術的研力度。黃曲霉毒素（AF）對人體健康存在較強的威脅，因此，研究人員對食品黃曲霉毒素檢測技術的研究較為深入。考慮到黃曲霉毒素對人體的危害性以及其存在的廣泛性，以往單一的檢測技術已經難以滿足實際應用需求，因此現階段針對黃曲霉毒素的檢測技術呈現出多元發展趨向，現有技術可分為生物分析法、理化分析法、免疫分析法等幾項類別，在實際應用過程中取得了較大成效。基于此，本文以堅果食品為例，分析高效液相色譜法在檢測食品中黃曲霉毒素的應用。

關鍵詞：黃曲霉毒素;高效液相色譜法;應用

中圖分類號：R155.5

0引言

黃曲霉毒素是一種由黃曲霉及寄生曲霉在聚酮作用影響下產生的有毒次生代謝物，它對人體造成的實際危害包括慢性中毒、生長障礙、癌癥等。現階段，技術人員在對其進行充分研究后，分離并鑒定出12種對人體威脅較大的黃曲霉毒素，存在與谷物、堅果等食品之中。從實際情況分析，黃曲霉毒素的產生菌廣泛存在于自然界中，這就導致黃曲霉毒素污染可能產生在食品生產的任意一個環節之中[1]。針對黃曲霉毒素最好的處理方案即是消除污染源，最大程度上避免黃曲霉毒素污染食品。目前國內外研究界已經將食品黃曲霉毒素總量檢測技術作為重點研究課題之一。

1高效液相色譜法原理概述

從本質層面分析，高效液相色譜法的原理為在適當地流動相條件下，利用反相C18色譜柱對經過凈化的樣品黃曲霉毒素總量進行分離操作，隨后針對黃曲霉毒素所具備的熒光特性，采用熒光檢測器對其進行定性以及定量檢測。西方研究者者RAO等在1973年建立高效液相色譜法，該方法的優勢在于可以同時針對B1、B2、G1、G2這四種黃曲霉毒素進行檢測，檢測量可以達到1μg/kg。研究界在他們的研究成果上不斷進行深化，發展出正相以及反相液相色譜法兩種類別，其中反相色譜檢測法在靈敏性以及穩定性方面具備更強的優勢，但也存在一定的短板，實際檢測過程中可以有效針對B2、G2進行檢測，但B1、G1在含水溶劑中，其熒光出現淬滅的幾率較大，進而導致無法有效檢測，因此實際進行過程中需要進行柱前或是柱后衍生，易達成增強分子熒光強度的目的。

高效液相色譜法的優勢在于分辨率高，靈敏性強，實際應用過程中可以有效保障檢測結果的可靠性，同時可以利用信息系統實現自動化操作，適用于對大批量樣品進行定性、定量以及多元分析，現階段該方法是當前國內外食品黃曲霉毒素總量檢測的權威方法[2]。但是該方法同樣具備一定短板，即對精密設備要求較高且價格昂貴，對檢測人員的技術水平具有較高要求，同時樣本需要進行前處理，無法應用于需要進行快速、現場檢測的場合。

2食品黃曲霉毒素總量檢測條件概述

本文所研究的技術為針對堅果食品黃曲霉毒素總量檢測的免疫親和柱凈化高效液相色譜法，試驗中應用的色譜儀設備以及熒光檢測設備為日本HITACHI公司產品;高速勻質器性能為18000～22000r/min，采用Warning公司產品;6位泵流操作架以及光化學柱衍生器采用國產設備，由北京中檢健康技術有限公司生產;C-18柱采用美國clover公司生產設備。

試驗所用試劑主要包括黃曲霉毒素總量免疫親和柱以及黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標準品兩種，分別為北京中檢健康技術有限公司以及美國supeleco公司產品。

本次試驗中主要針對色譜柱、流動相以及流速等條件進行設置。試驗中所用色譜柱規格為4.6mm×150mm，5μg;流動相設置為甲醇—水，二者之間的比例為45：55;試驗流速設定為0.8mL/min。本次試驗過程中對熒光檢測器激發波長以及發射波長進行設置，標準分別為360nm以及440nm[3]。進樣體積控制在20～100μL區間范圍內。

3檢測試驗過程

本次試驗的目的為利用免疫親和柱凈化高效液相色譜法對堅果食品黃曲霉毒素總量進行檢測，在實際試驗過程中需要首先對黃曲霉毒素標準品進行配置并構建標準曲線。在操作過程中將B1、B2、G1、G2進行混合配置并將其濃度調配為2600μg/L。其中B1、G1以及B2、G2的濃度存在差異，分別為1000μg/L以及300μg/L。隨后試驗人員利用流動相對標準品進行配置，混合標準品的質量濃度依次為2.6、13、26、52、104μg/L，隨后將其注入至液相色譜檢測儀中，并針對B1、B2、G1、G2分別建立標準曲線。

在完成黃曲霉毒素標準品的配置工作后，需要對樣品進行處理。實際處理過程中需要首先對樣品進行磨細處理，確保其粒度控制在2mm以下，隨后精準稱取50g樣品將其至于250ml具塞錐形瓶中，加入氯化鈉以及流動相，其規格分別為5g以及100mL，完成此項操作后使用均質器對其進行高速攪拌提取處理，時間控制在2min。隨后利用定量濾紙進行過濾，對濾液進行移取處理，移取量應精準控制在10mL，并加入40mL純水以達成稀釋目的，隨后利用玻璃纖維濾紙再次進行過濾[5]。

免疫親和柱應與10mL玻璃注射器相連接，并將其放置在6位泵流操作架之上，隨后取10mL樣品處理液并將其注入至玻璃注射器之中，利用空氣壓力泵設備推動溶液以1滴/s的流速通過免疫親和柱，2～3mL空氣通過柱體即可關閉壓力泵。用10mL純水對柱體進行淋洗處理，反復操作兩次并確保全部流出液均已棄流，隨后再次推動2～3mL空氣通過柱體。之后取2mL色譜級甲醇開展洗脫處理，此過程中應注意將流速控制在1滴/s，同時應對洗脫液進行收集并進行混勻處理，隨后注入高效液相色譜儀進行檢測。

樣品處理步驟完成后，即可開展添加回收實驗。試驗中選擇花生、核桃、腰果作為樣品開展試驗，分別對不同樣品添加B1、B2、G1、G2混合標準品，質量分數梯度設定為5.2，26，52μg/kg，不同梯度應分別進行5組平行試驗，隨后對回收率以及精密度進行計算。

4檢測試驗結果分析

4.1光化學衍生器衍生成效

在實際開展本次試驗過程中充分認識到B1、G1在遇水后其熒光產生淬滅的幾率較大，進而出現液相色譜檢測法失效的情況，因此，決定采用光化學衍生提升B1、G1熒光性的方式，極大地提升了檢測靈敏性以及有效性。從實際結果分析，在26μg/L質量濃度條件下，經過光化學衍生加強后B1、G1熒光性得到顯著增強。圖1中（a）與（b）分別為26μg/L質量濃度條件下未經光化學衍生增強以及經過光化學衍生增強的色譜圖。

4.2標準曲線

本文所研究試驗中，配置了2.6、13、26、52、104μg/L質量濃度的黃曲霉毒素混合標準品，將其分別注入液相色譜檢測后，針對B1、B2、G1、G2分別建立標準曲線。從最終結果分析可知，B1、B2、G1、G2四種標準品質量濃度及其峰面積之間呈現出較好的線性關系。表1為黃曲霉毒素混合標準現行回歸方程。

4.3樣品添加回收率及精密度

本文所研究試驗選取花生、核桃、腰果作為樣品開展黃曲霉毒素總量檢測試驗，試驗過程中分別在樣品中添加不同質量濃度的混合標準品，分別為5.2、26以及52μg/kg，最終測定結果如下：花生樣品的回收率以及精密度區間范圍分別為85%～94.5%以及2.98%～6.54%;核桃樣品的回收率以及精密度區間范圍分別為83.2%～94.2%以及1.65%～6.32%;花生樣品的回收率以及精密度區間范圍分別為81.3%～96%以及3.54%～6.13%[6]。

樣品中測定的B1、B2、G1、G2加標回收率以及精密度結果如表2所示。

依據試驗結果可知，在10倍信噪比計算定量限條件下，確定黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法靈敏度，分別為0.1μg/kg、0.05μg/kg、0.1μg/kg、0.15μg/kg。

以花生樣品為例，其在添加質量濃度為26μg/L的黃曲霉毒素標品后測得的色譜圖如圖1所示。

5總結

綜上所述，本文所研究的免疫親和柱凈化—高效液相色譜法在檢測黃曲霉毒素過程中具備操作簡便的優勢，同時凈化過程也取得了預期成效。運用光化學衍生方式提升黃曲霉毒素B1、G1的熒光性后，該方法的檢測有效性得到了極大的提高。在1.0～40.0μg/L（B1，G1）以及0.3～12.0μg/L（G1，G2）線性范圍內，所得回歸方程的相關系數均大于0.9999。經過實際檢測后，可以得出樣品的回收率控制在81.3%～96.0%范圍內以及精密度小于10%的結論，同時，試驗數據表明其靈敏度很高。本方法試劑用量少、準確度高、靈敏度高，可以有效應用于堅果食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總含量的檢測。

參考文獻

[1]張宏博，靳志敏，高智慧，等.食品中黃曲霉毒素B1檢測方法研究[J].食品安全導刊，2019，228（Z1）：70-73.

[2]李穎之.食品中黃曲霉毒素B1檢測方法研究[J].大科技，2019，（015）：254-255.

[3]馬騰達，王慧玲，周鳳霞，等.黃曲霉毒素B1在食品檢測中的研究新進展[J].吉林農業，2019，451（10）：81.

[4]吳震，宗婧，李晨曦，等.基于光激化學發光均相免疫檢測技術的黃曲霉毒素檢測方法研究[J].光學技術，2019，45（001）：117-123.

[5]王亞楠，王曉斐，王自良.食品黃曲霉毒素總量檢測方法的研究與應用[J].食品與發酵工業，2018，44（01）：285-290.

[6]張元杰.ELISA法檢測煎餅類食品中黃曲霉毒素含量[J].中國農村衛生，2018（10）：12-13.

作者簡介：劉揚（1991-），女，遼寧本溪人，工程師，漢族，碩士研究生，畢業于東北農業大學，食品科學專業，主要從事食品質量檢驗檢測工作。