農桿菌介導臺農17號菠蘿遺傳轉化相關因素優化

郭利軍　梁其干　范春節　鄧會棟　華敏　馮學杰　羅志文　陳哲

摘 要：為建立穩定的農桿菌介導的菠蘿遺傳轉化體系，以臺農17號菠蘿幼嫩愈傷組織為試驗材料，以GUS基因瞬時表達率為遺傳轉化效果評價指標，應用單因素試驗法，研究了卡那霉素對臺農17號菠蘿愈傷組織不定芽分化的影響以及不同菌株、菌液濃度、共培養時間和乙酰丁香酮的添加等轉化相關因素對菠蘿遺傳轉化的影響。結果表明，80mg/L卡那霉素濃度可完全抑制不定芽分化，農桿菌菌株采用LBA4404，菌液濃度OD600為0.8，共培養4d時遺傳轉化效果最佳，GUS基因瞬時表達率達到39.44%，而菌液中添加乙酰丁香酮未明顯提高GUS基因瞬時表達率。研究初步建立了農桿菌介導的臺農17號菠蘿遺傳轉化體系，為開展菠蘿關鍵基因功能驗證和品種改良搭建了遺傳轉化平臺。

關鍵詞：農桿菌介導;臺農17號菠蘿;遺傳轉化體系

中圖分類號 S667.8 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2021）21-0022-06

Abstract： In order to establish a stable agrobacterium-mediated genetic transformation system of pineapple， young callus of Tainong16 Pineapple was taken as experimental material， the effect of kanamycin on the callus differentiation and genetic transformation effect of agrobacterium strains， bacterial concentration， co-culture time， and addition of acetosyringone were studied by using single factor test method， the GUS gene transient expression rate was used as evaluation index of genetic transformation effect. Results showed that the concentration of kanamycin fully suppressing bud differentiation was 80 mg/L. The good results of genetic transformation effect with the 39.44% of the GUS gene transient expression rate can be obtained under the conditions of the agrobacterium strain using LBA4404， bacterial liquid concentration with an OD600 value of 0.8 and co-culture time for 4 days. The GUS gene transient expression rate was not significantly increased when acetosyringone was added into the bacterial fluid. It had been preliminarily established a system for agrobacterium-mediated transformation of Tainong17 pineapple， which provided a genetic transformation platform for functional verification of key genes and pineapple′s variety improvement.

Key words： Agrobacterium-mediated; Tainong17 pineapple; Genetic transformation system

菠蘿[Ananas comosus （L.） Merr.]為鳳梨科鳳梨屬植物，是華南地區重要的經濟作物。2006年起課題組開展了包括乙烯誘導菠蘿催花等在內的一系列技術研發工作，目前已克隆LEAFY[1]、FT[2]、TCP[3]、COL[4]等多個參與花芽分化的基因。臺農17號菠蘿是從眾多菠蘿種質資源中篩選出的優良品種，根據受乙烯誘導開花的程度，將其劃為乙烯誘導開花鈍感型品種，它是研究菠蘿開花機理的優異材料。然而，菠蘿遺傳轉化體系的缺失嚴重阻礙了乙烯誘導菠蘿開花機制的研究，為了實現開花鈍感型和敏感型的互相轉換，驗證花芽分化關鍵基因功能，從分子水平闡明菠蘿開花機理，建立臺農17號菠蘿遺傳轉化體系平臺就顯得非常必要。

農桿菌介導法具有易操作、低拷貝、遺傳穩定性強等特點，被廣泛應用于植物轉基因研究[5]。目前，菠蘿轉基因研究普遍采用農桿菌介導法，遺傳轉化對象主要集中在神灣、皇后等皇后類菠蘿上[6-8]。已有研究表明，不同菠蘿品種間的遺傳轉化參數有著較大的不同，甚至同一菠蘿品種也存在一定差別[9]。目前，有關臺農系列菠蘿遺傳轉化研究鮮有報道，為此，本研究就影響農桿菌介導臺農17號菠蘿遺傳轉化效率的相關因素，包括卡那霉素對愈傷組織不定芽分化的影響以及不同菌株、菌液濃度、共培養時間和乙酰丁香酮的添加等，對菠蘿遺傳轉化的影響進行了探討，以期為建立穩定的臺農17號菠蘿遺傳轉化體系提供理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與條件 將臺農17號菠蘿組培增殖單芽置于MS+6-BA 3mg/L+NAA 2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH 5.8培養基中，在溫度28℃、黑暗條件下培養30d左右，即可產生大量幼嫩愈傷組織。將幼嫩愈傷組織切成0.5cm左右的小塊作為開展遺傳轉化因素優化試驗材料，黑暗條件下置于再生培養基上進行預培養和共培養，培養基為MS+6-BA 2mg/L+NAA 1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH 5.8。農桿菌培養基為LB培養基，具體為，蛋白胨10g/L+酵母浸膏5g/L+氯化鈉10g/L+卡那霉素50mg/L+利福平10mg/L+瓊脂12g/L，pH 5.8;培養基在0.11 MPa壓力下，121℃滅菌16min后冷卻待用。菌株由中國林業科學研究院熱帶林業研究所提供，菌株內含有攜帶NOS啟動子、CaMV35S啟動子、NOS終止子、NPTⅡ基因和GUS基因的載體質粒pBI121（圖1）。

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圖1 質粒pBI121酶切和結構圖譜

取-75℃凍存的農桿菌菌株，在冰上解凍后劃平板活化培養3d。挑取單菌落于4mL液體LB培養基中，在180r/min轉速搖床過夜培養。當菌液OD600值達到0.2后，按照1∶40（v/v）比例接入新鮮LB液體培養基中，培養至指定濃度，2810×g離心8min，再用等量的液體再生培養基重懸菌體用于后期侵染。

6-BA（產品編號A600743，純度≥98%）、NAA（產品編號A600729，純度≥98%）、DMSO（產品編號A503039，純度≥99%）、乙酰丁香酮（產品編號A601111，純度≥98%）、卡那霉素（產品編號A506636，純度為USP Grade），利福平（產品編號A600812，純度為USP Grade）等試劑均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 遺傳轉化基本條件 研究主要針對卡那霉素對愈傷組織再生的影響以及不同農桿菌菌株、菌液濃度、侵染時間、共培養時間以及乙酰丁香酮的添加等影響遺傳轉化影響因子開展相關試驗，以GUS基因瞬時表達率作為評價遺傳轉化效果指標[10]。遺傳轉化基本條件為：黑暗條件下預培養3d，菌液濃度OD600值0.5時侵染愈傷組織30min，將愈傷組織接種至共培養基暗培養3d，參照Jefferson等[11]的方法，對共培養結束的愈傷組織進行染色，統計染色率。遺傳轉化因素優化試驗采用逐步優化法進行，每因素試驗優化的結果將作為下一因素試驗的條件。

1.3 遺傳轉化因素的優化試驗

1.3.1 卡那霉素 設置不同濃度卡那霉素以測試臺農17號菠蘿愈傷組織的卡那霉素本底抗性。卡那霉素濃度為0、10、20、30、40、50、60、80mg/L，統計再生率，稱量愈傷組織重量，評價卡那霉素對愈傷組織再生的影響。

1.3.2 農桿菌菌株 采用GV3101、LBA4404、AGL1和EHA105等4種不同菌株，參照遺傳轉化基本條件，待共培養結束后，統計不同菌株侵染條件下的GUS基因瞬時表達率。

1.3.3 菌液濃度 菌液濃度OD600設置為0.2、0.4、0.6、0.8，采用1.3.2篩選出的農桿菌菌株，其他試驗條件參照遺傳轉化基本條件，待共培養結束后，統計不同菌液濃度條件下的GUS基因瞬時表達率。

1.3.4 共培養時間 將侵染后的愈傷組織置于共培養基上，分別培養1、2、3、4 d，采用1.3.2和1.3.3篩選出的結果，其他試驗條件參照遺傳轉化基本條件，待共培養結束后，統計不同共培養天數條件下的GUS基因瞬時表達率。

1.3.5 菌液添加乙酰丁香酮 培養農桿菌至指定濃度，用等量的液體再生培養基重懸菌體后，在菌液中分別添加0、50、100、200mg/L等4種不同濃度乙酰丁香酮，采用1.3.2、1.3.3和1.3.4篩選出的結果，其他試驗條件參照遺傳轉化基本條件，待共培養結束后，統計不同乙酰丁香酮濃度條件下的GUS基因瞬時表達率。

1.4 評價指標與數據統計分析

1.4.1 評價指標 相關公式如下：

卡那霉素對愈傷組織再生的影響試驗評價指標為再生率，再生率（%）=[出芽的愈傷組織數量愈傷組織總數量]×100;

遺傳轉化評價效果指標為GUS基因瞬時表達率，GUS基因瞬時表達率（%）=[被染藍的愈傷組織數量愈傷組織總數量]×100

1.4.2 數據處理與統計分析 按照郭利軍等的方法，將愈傷組織重量值進行平方根轉化SQRT（X），再生率和GUS基因瞬時表達率值經平方根后反正弦化ASIN（SQRT（X）），采用IBM SPSS Statistics 22軟件進行數據統計與方差分析（ANOVA）和Duncan′s多重比較[12]。

2 結果與分析

2.1 卡那霉素對愈傷組織再生的影響 試驗結果表明，隨著卡那霉素濃度的升高，再生率和愈傷組織重量呈現逐漸下降的趨勢，卡那霉素對愈傷組織的增殖和再生產生了顯著影響（表1、圖2）。從再生率指標來看，隨著卡那霉素濃度的升高，再生率從最高的87.66%逐步下降至0%。與0～40mg/L 5個處理比較，當卡那霉素濃度達到50mg/L時，其再生率從87.66%顯著下降至35.98%;而達到60～80mg/L時，其再生率大幅下降至0%～8.89%。從愈傷組織重量指標來看，卡那霉素濃度達到50mg/L后，重量值為0.38g，顯著低于0～40mg/L5個處理水平值;達到60～80mg/L后，重量值降為0.24～0.28g，達到最低水平值。所以進行菠蘿轉化芽篩選時，經農桿菌侵染的愈傷組織材料培養初期卡那霉素濃度可選擇50mg/L，隨著愈傷組織的逐漸分化和再生，卡那霉素濃度可再逐步從60mg/L提高至80mg/L，以最大程度降低假陽性百分率和轉基因芽的逃逸率。

2.2 農桿菌菌株對遺傳轉化的影響 比較不同農桿菌菌株GV3101、LBA4404、AG1和EHA105對遺傳轉化的影響，結果顯示，不同農桿菌菌株的GUS基因瞬時表達率存在顯著差異（表2）。其中，GV3101和LBA4404的GUS基因瞬時表達率顯著高于AG1和EHA105。雖然GV3101和LBA4404的GUS基因瞬時表達率無明顯差別，但LBA4404的GUS基因瞬時表達率達到26.67%，高于GV3101，所以研究選擇LBA4404作為介導遺傳轉化的農桿菌菌株。

2.3 菌液濃度對遺傳轉化的影響 試驗結果表明，不同菌液濃度間的GUS基因瞬時表達率存在顯著差別（表3）。隨著菌液濃度的增高，GUS基因瞬時表達率從11.11%逐步提高至35.56%，當菌液濃度OD600值達到0.6時，GUS基因瞬時表達率達到32.22%，與OD600值為0.8對應的GUS基因瞬時表達率35.56%已無明顯差異，所以OD600值0.6～0.8是適合遺傳轉化的菌液濃度，本研究選用GUS基因瞬時表達率稍高的OD600值0.8作為下一步試驗的菌液濃度。

2.4 共培養時間對遺傳轉化的影響 不同共培養時間條件下，GUS基因瞬時表達率存在顯著差異，并且隨著共培養時間的延長，GUS基因瞬時表達率逐漸增高，當共培養時間達到3d后，GUS基因瞬時表達率達到38.65%，與共培養4d的GUS基因瞬時表達率39.44%無顯著差別（表4）。所以本研究選擇表達率稍高的4d處理作為共培養時間條件。

2.5 菌液添加乙酰丁香酮對遺傳轉化的影響 菌液中添加乙酰丁香酮似乎對遺傳轉化產生了不利影響。雖然100mg/L處理GUS基因瞬時表達率38.02%高于對照的36.34%，但與對照相比，100mg/L處理并未顯著提高GUS基因瞬時表達率。而添加50mg/L和200mg/L 2個處理的GUS基因分別為29.54%、23.64%，與對照相比，也未明顯提高GUS基因瞬時表達率，反而產生了抑制作用（表5）。本著降低試驗成本的原則，所以菌液中不再添加乙酰丁香酮。

3 結論與討論

本研究以誘導的幼嫩愈傷組織為試驗材料，采用農桿菌介導法，針對相關遺傳轉化因素開展了系列優化試驗。結果表明，卡那霉素達到80mg/L時可完全抑制不定芽分化，農桿菌菌株采用LBA4404，菌液濃度OD600為0.8，共培養4d時遺傳轉化效果最佳，GUS基因瞬時表達率達到39.44%，而菌液中添加乙酰丁香酮未明顯提高GUS基因瞬時表達率。研究初步建立了農桿菌介導的臺農17號菠蘿遺傳轉化體系，為開展菠蘿關鍵基因定向編輯、功能驗證和品種改良搭建了遺傳轉化平臺。

預試驗發現，采用培養30d左右較為幼嫩的愈傷組織材料，可取得較好的瞬時表達效果，而愈傷組織培養不足20d或者大于50d遺傳轉化效果相對較差，這與神灣菠蘿愈傷組織SERK1基因5′上游調控序列啟動子活性的瞬時表達分析結果是高度一致的[13];農桿菌介導荔枝遺傳轉化研究也證明，愈傷組織繼代培養不同時間會對GUS基因瞬時表達效果產生顯著影響，其認為繼代培養15d的胚性愈傷組織處于最旺盛分裂的時期，易于接受外源DNA[14]。所以開展菠蘿遺傳轉化研究，建議選用旺盛分裂時期的幼嫩愈傷組織作為侵染材料，避免選擇老化的愈傷組織。

巴厘菠蘿采用濃度為50mg/L的卡那霉素篩選轉化菠蘿植株[15]，皇后菠蘿采用濃度為100mg/L的卡那霉素篩選轉化菠蘿植株[16-18]，神灣菠蘿卡那霉素采用20mg/L作為初步篩選濃度，再生階段采用30～50mg/L的卡那霉素[19]。本研究建議臺農17號菠蘿早期卡那霉素選擇50mg/L，隨著愈傷組織的分化，可逐步提高至60mg/L，至再生階段可提高至80mg/L。同時，以上研究結果也表明，不同菠蘿品種的卡那霉素本底抗性有所不同，其采用的卡那霉素篩選策略也有所不同。產生這種差異的原因可能是：（1）不同菠蘿品種遺傳背景不同，各自擁有不同的卡那霉素本底抗性水平;（2）在經歷長時期繼代培養后，無性繁殖材料可能存在生理和遺傳上的變異[20]，導致卡那霉素抗性水平發生變化。所以基于不同的試驗和材料培養條件，開展卡那霉素抗性試驗是非常必要的。

目前，國內外菠蘿遺傳轉化研究多采用農桿菌介導法，但所采用的農桿菌菌株、菌液濃度和共培養時間均有一定差別。同是以葉片基部0.5～1cm的部分作為農桿菌侵染材料，皇后菠蘿采用的是將過夜培養的EHA105菌株稀釋10～20倍，共培養3d[18]，無刺卡因菠蘿采用的是農桿菌菌株C58PmP90、EHA101和LBA4404，OD600為1.4～1.6，共培養2d[7];這表明，不同菠蘿品種同一侵染部位的材料，其所采用的遺傳轉化參數是有所差別的。

同是以神灣菠蘿葉基誘導的愈傷組織為農桿菌侵染材料，Ma等[19]等采用的農桿菌菌株是LBA4404，OD600為1，共培養3d;Luan等[13]采用的農桿菌菌株是GV3101，OD600為0.5，共培養2d;同是以無刺卡因菠蘿愈傷組織為侵染材料，Espinosa等[21]采用的是LBA4404和AT2260，其OD600值為10（按照[22]關于OD600值為0.1相當于農桿菌菌株1×107 cfu/ml的標準），共培養時間為1d，而Firoozabady等[8]采用的是農桿菌菌株是GV3101，OD600值為2～3，共培養3d;這表明，即使是同一菠蘿品種同種侵染材料，其采用的遺傳轉化參數也存在較大不同。

本研究以臺農17號菠蘿幼嫩愈傷組織為侵染對象，采用農桿菌菌株LBA4404，菌液濃度OD600為0.8，共培養時間設置3d開展遺傳轉化研究，與上述菠蘿品種所采用的參數有所不同，進一步驗證不同菠蘿品種間遺傳轉化參數是不完全一致的，也說明了開展本研究的必要性。

據報道，菌液中添加乙酰丁香酮能夠顯著誘導增強農桿菌的侵染活力[23]，而本研究于菌液中添加乙酰丁香酮，GUS基因瞬時表達率并未明顯提高，這與[24]的研究結果相符。分析產生這種情況的原因，一方面可能是添加50mg/L的乙酰丁香酮濃度過高所致。有報道，菌液中添加20mg/L乙酰丁香酮會抑制遺傳轉化，降低GUS基因染色率[25，26];另一方面可能與溶解乙酰丁香酮的有機溶劑二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）有關。農桿菌介導的遺傳轉化研究普遍采用DMSO溶解乙酰丁香酮[27，28]，所以本研究也同樣采用DMSO溶解乙酰丁香酮。而DMSO對細胞膜具有很強的親和力，可協助脂溶性藥物透過細胞膜，但DMSO超過一定濃度對神經細胞株PC12有害，對細胞的生長會產生不利影響[29]。同時，DMSO還有抑制大腸桿菌生長和繁殖的作用[30]，所以未能有效促進遺傳轉化效果的原因可能是DMSO對愈傷組織細胞和農桿菌細胞產生了毒害和抑制作用，雖然乙酰丁香酮能夠增強農桿菌的侵染活力，但其誘導的侵染活力程度不足以抵消DMSO所產生的傷害。

共培養基中添加磷酸甜菜堿和脯氨酸等滲透保護劑可提高農桿菌介導的李和蘋果的遺傳轉化效率[31]，下一步擬調整乙酰丁香酮溶劑，同時在菌液和共培養基中應用磷酸甜菜堿和脯氨酸等滲透保護劑，進一步優化相關參數提高遺傳轉化效率，為開展目標基因的定向編輯提供高效平臺支撐。

參考文獻

[1]年宇薇，陳哲，胡福初，等.菠蘿LEAFY基因克隆與表達模式研究[J].分子植物育種，2018，16（7）：2107-2115.

[2]阮城城，年宇薇，胡福初，等.乙烯利誘導菠蘿成花過程中FT基因的克隆與表達分析[J].果樹學報，2019，36（12）：1648-1657.

[3]阮城城，胡福初，羅志文，等.菠蘿TCP基因家族的鑒定及成花誘導階段的表達譜分析[J].果樹學報，2020，37（11）：1623-1635.

[4]阮城城，胡福初，王祥和，等.菠蘿COL基因的克隆及響應乙烯的表達特性分析[J].熱帶作物學報，2021，42（1）：7-16.

[5]Hwang Hau Hsuan，Yu Manda，Lai Erhmin. Agrobacterium-mediated plant transformation：biology and applications[J].The Arabidopsis Book，2017，15：e186.

[6]Wang M. L.，Uruu G.，Xiong L.，et al. Production of transgenic pineapple （Ananas cosmos （L.） Merr.） plants via adventitious bud regeneration[J].In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant，2009，45（2）：112-121.

[7]Ko H. L.，Campbell P. R.，Jobin-Décor M. P.，et al. The introduction of transgenes to control blackheart in pineapple （Ananas Comosus L.） cv. Smooth Cayenne by microprojectile bombardment[J].Euphytica，2006，150（3）：387-395.

[8]Firoozabady E.，Heckert M.，Gutterson N. Transformation and regeneration of pineapple[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2006，84（1）：1-16.

[9]Wangming Li，Paull Robert E.，Genetic transformation of pineapple[M].Heidelberg，Germany：Springer，2018：69-86.

[10]Moazami K.，Mortazavi S. E.，Heidari B.，et al. Agrobacterium-mediated transient assay of the Gus gene expression in sugar beet[J].Annual Research & Review in Biology，2018，30（1）：1-7.

[11]Jefferson Richard A.，Kavanagh Tony A.，Bevan Michael W. GUS fusions：beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.[J].The EMBO journal，1987，6（13）：3901-3907.

[12]郭利軍，曾炳山，劉英.農桿菌介導巨桉Eg5高效遺傳轉化[J].植物學報，2013，48（1）：87-93.

[13]Luan Aiping，He Yehua，Xie Tao，et al. Identification of an embryonic Cell-specific region within the pineapple SERK1 promoter[J].Genes，2019，10（11）：883-893.

[14]曾黎輝. 農桿菌介導荔枝（Litchi chinensis Sonn.）遺傳轉化體系的建立及導入LEAFY基因研究[D]：福建農林大學，2002.

[15]Lü Ling Ling，Duan Jun，Xie Jiang Hui，et al. Cloning and expression analysis of a PISTILLATA homologous gene from pineapple （Ananas comosus L. Merr）[J].International Journal of Molecular Sciences， 2012，13（1）：1039-1053.

[16]Gangopadhyay Gaurab，Roy Subhash Kanti，Gangopadhyay Sangita Basu，et al. Agrobacterium-mediated genetic transformation of pineapple var. Queen using a novel encapsulation-based antibiotic selection technique[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2009，97（3）：295-302.

[17]Agrobacterium-Mediated Transformation of Pineapple （Ananas comosus L. Merr.） Leaf Bases with MSI-99，a Magainin Analogue[M]

[18]Mhatreminal，Nagi L.，Ganapathi T. R. Agrobacterium-mediated transformation of pineapple （Ananas comosus L. Merr.） leaf bases with MSI-99，a magainin analogue[J].International journal of fruit science，2009，9（1）：106-114.

[19]Ma Jun，He Ye Hua，Wu Cheng Hou，et al. Effective agrobacterium-mediated transformation of pineapple with CYP1A1 by kanamycin selection technique[J].African Journal of Biotechnology，2012，11（10）：2555-2562.

[20]劉福平，陳淳，程小兵，等.培養基中附加6-BA長期繼代培養對蝴蝶蘭類原球莖活力及生理生化指標的影響[J].熱帶作物學報，2021，42（2）：428-435.

[21]Espinosa P.，Lorenzo J.，Iglesias A.，et al. Production of pineapple transgenic plants assisted by temporary immersion bioreactors[J].Plant Cell Reports，2002，21（2）：136-140.

[22]Morton Elise R.，Fuqua Clay. Phenotypic analyses of agrobacterium[J].Current protocols in microbiology，2012，25（1）：3.

[23]董喜才，杜建中，王安樂，等.乙酰丁香酮在植物轉基因研究中的作用[J].中國農學通報，2011，27（5）：292-299.

[24]楊秀榮，陳永文，方平，等.乙酰丁香酮對根癌農桿菌介導的甘薯遺傳轉化的影響[J].西南師范大學學報（自然科學版），2002，27（5）：751-754.

[25]武小霞，李靜，王志坤，等.乙酰丁香酮濃度和共培養pH對大豆再生頻率的影響[J].東北農業大學學報，2010，41（5）：1-4.

[26]寧宇，李蕾，苗永美，等.乙酰丁香酮及共培養pH對黃瓜遺傳轉化效率的影響[J].中國瓜菜，2013，26（5）：6-9.

[27]Ma Lisong，Lukasik Ewa，Gawehns Fleur，et al，The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves[M].Heidelberg，Germany：Springer，2012：61-74.

[28]Murugan Naveenarani，Mohan Chakravarthi，Kannan Baskaran，RNAi-based gene silencing in sugarcane for production of biofuel[M]：Springer，2021：141-155.

[29]劉耳，王金兵，吳燕.細胞凍存保護劑二甲基亞砜的細胞毒作用[J].中國畜禽傳染病，1994，4：50-52.

[30]常曉杰，徐穎超，劉暢.不同實驗方法檢測常用有機溶劑對細菌活性的影響及其安全使用限量[J].微生物學通報，2016，43（7）：1635-1645.

[31]牛淑慶，陳麗，李雨欣，等.根癌農桿菌介導蘋果愈傷組織遺傳轉化體系的優化[J].北京農學院學報，2021，36（1）：37-41.

（責編：張宏民）