離心分配色譜法對達烏里芯芭中毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的分離純化

夏 瑩，張明旭，秦 玲，高 冰,李旻輝,

(1.內蒙古自治區中醫藥研究所，內蒙古 呼和浩特 010020；2.包頭醫學院)

達烏里芯芭(Cymbaria dahurica L.)是一種多年生草本，別名芯芭、大黃花和白蒿茶，蒙名興安奈-哈吞-額布斯，主要生于典型草原、荒漠草原和山地草原上，在內蒙古呼倫貝爾市、赤峰市、烏蘭察布、包頭市等地區廣泛分布。達烏里芯芭是一種傳統蒙藥材，蒙藥名為韓琴色日高，以全草入藥，具有祛風濕、止血利尿等功效，主治風濕性關節炎、月經過多、吐血、腎炎水腫、黃水瘡等病癥[1]。

目前對于達烏里芯芭化學成分的研究主要集中于環烯醚萜等成分[2]。在課題組的前期研究中，首次發現達烏里芯芭中含有毛蕊花糖苷(Acteoside)和異毛蕊花糖苷(Isoacteoside)[3]，其化學結構式如圖1所示。毛蕊花糖苷具有廣泛的藥理活性，如腎功能保護、免疫調節、抗氧化、抗細胞凋亡、抗高血壓等作用[4]。異毛蕊花糖苷也在體內體外實驗中展現出了防止神經紊亂和認知障礙等作用[5]。

圖1 毛蕊花糖苷(Acteoside)和異毛蕊花糖苷(Isoacteoside)的化學結構式

離心分配色譜法(centrifugal partition chromatography, CPC)是現代逆流色譜法中的一種液-液分配色譜技術。物質分離的原理是基于其在兩種不相容的溶液中不同的分配系數而實現的，其簡單、重復性好、適合分離天然產物中活性成分的特性受到研究人員的青睞[6]。雖然在以往的研究中，已有對其他植物中毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的分離，如曹馨元等人使用中壓柱色譜技術分離制備毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷單體[7]、常敬娟使用制備液相色譜分離了北美車前草中的毛蕊花糖苷[8]。而離心分配色譜可以實現更高的生產效率和更低的生產成本，對毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的開發具有重要意義。

本研究旨在探索一種使用離心分配色譜法對達烏里芯芭中的毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷進行分離純化的方法，為進一步實現達烏里芯芭產業化的開發利用和毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的廣泛應用提供途徑。

1 材料與試劑

1.1藥材來源 達烏里芯芭藥材于2018年6月采集于內蒙古自治區錫林郭勒盟東烏珠穆沁旗賀斯格烏拉農牧場馬希拉哈達。樣品由包頭醫學院生藥教研室張春紅教授鑒定為玄參科(Scrophulariaceae)芯芭屬(Cymbaria L.)的植物達烏里芯芭(Cymbaria daurica L.)。

1.2試劑與儀器 毛蕊花糖苷標準品(批號: HE141730198)、異毛蕊花糖苷標準品(批號: HA141444298)采購于成都普菲德生物技術有限公司；乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等試劑均為分析純，甲醇和乙腈為色譜純。十萬分之一電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；IKA RV 10型旋轉蒸發儀(上海焓佩機電設備有限公司)；XJB-40-B型純水儀(沈陽欣潔科技有限公司)；PLC 2050離心分配色譜設備(北京吉爾森科技有限公司)；UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國熱電公司)；分液漏斗、燒杯等玻璃儀器產于四川屬牛玻璃儀器有限公司。

2 方法與結果

2.1毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的提取 稱取干燥達烏里芯芭全草1 450 g，將其粉碎成中細粉(過四號篩)。采用加熱回流法，用70 %乙醇提取1 h(物料比1∶10)，靜置冷卻后過濾提取液。按照上述方法反復提取3次。合并提取液，使用旋轉蒸發儀進行減壓濃縮，得到醇提取物粗浸膏362.5 g。將醇提取物粗浸膏加水溶解后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，各部分萃取液分別用旋轉蒸發儀減壓濃縮成浸膏，最終得到石油醚部位浸膏55.91 g，乙酸乙酯部位浸膏21.47 g，正丁醇部位浸膏110.77 g和水部位浸膏174.26 g。經高效液相色譜法檢測，毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷主要存在于正丁醇部分。

2.2毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的分離 將乙酸乙酯、正丁醇和超純水按照體積比4∶1∶5的比例充分混合，配備離心分配色譜溶劑系統[9]。溶劑系統在分液漏斗中靜置過夜，取上相作為固定相，下相為流動相。將固定相和流動相分別在常溫，80W的條件下，超聲15 min除氣泡備用。稱取萃取得到的正丁醇浸膏樣品101.3 mg溶解在10 mL下相中，經0.45 μm微孔濾膜過濾，作為樣品備用。

高速離心分配色譜儀器設置為降相模式，以10 mL/min的流速和500 r/min的轉速將固定相泵入色譜柱中；12 min后，調節流速為3 mL/min，轉速為1500 r/min后再注入流動相，18 min達到平衡狀態，即可進樣。

將樣品由進樣閥注入，設定高速離心分配色譜儀器運轉時間90 min，用紫外檢測器在320 nm波長下檢測，自動收集到樣品管中(每管10 mL)。收集液均經高效液相色譜法(HPLC)鑒定，將組分相同部分進行合并。合并后的組分再次注入進樣閥，高速離心分配色譜儀器設定運轉時間90 min，用紫外檢測器在320 nm波長下檢測，自動收集到樣品管中(每管10 mL)，收集液經高效液相色譜法(HPLC)鑒定，將相同部分合并。最終將合并液進行減壓濃縮至干，得到目標化合物毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷,并計算得率。得率計算公式如下：

2.3結果 所得樣品均為白色粉末，與標準品進行HPLC檢測對比，樣品1為毛蕊花糖苷4.41 mg，純度為95.49 %, 得率為0.33 %；樣品2為異毛蕊花糖苷0.89 mg，純度為94.83 %，得率為0.07 %。如圖2所示。

圖2 毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷高效液相色譜圖

3 討論

苯乙醇苷類化合物毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷在自然界中分布廣泛，可以從肉蓯蓉、地黃等多種植物中提取分離得到[10-11]。這兩種化合物均展現出多種藥理作用且具有低毒，穩定性好的優點，但是傳統的提取分離方法相對困難、繁瑣，給其深入研究帶來了很大困難。離心分配色譜法因其快速、高效、低浪費的特性，有助于化合物大量分離純化時獲得更大經濟效益。因此將該種方法應用于芯芭中化合物的分離純化，對于促進達烏里芯芭資源利用開發具有重要意義。本實驗首次采用了一種離心分配色譜法對達烏里芯芭中毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷進行分離純化且純度較高。相比其他方法，該方法高效便捷，為達烏里芯芭藥用植物的工業化發展提供一種途徑。