沉默Galectin-3對人甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、侵襲能力影響及機制研究

胡永全，任 麗，郭道華，袁 超，陶新全，李衛鵬，劉恒超，申 勇，訾 剛

(1.蚌埠醫學院第一附屬醫院核醫學科，安徽 蚌埠 233004；2.蚌埠醫學院核醫學教研室；3.藥劑科)

甲狀腺癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，甲狀腺癌是近年來發病率增長最快的實體惡性腫瘤,其中分化型甲狀腺癌占新發甲狀腺癌的90 %以上[1]。乳頭狀癌是分化型甲狀腺癌中最常見的組織學類型，目前臨床上常見的治療手段有手術、131I治療、甲狀腺激素替代治療等，一般預后較好。盡管大多數分化型甲狀腺癌患者可以通過手術治愈，通常隨后進行131I治療和促甲狀腺激素抑制，但不能切除的局部復發和/或轉移性及放射性碘難治性患者的10年生存率低，存活率僅為19 %，治療難度大[2]?，F靶向藥物僅能改善碘難治性分化型甲狀腺癌的無進展生存期,不提高總生存期，其有一定不良反應，且用藥患者的選擇及適應證的把握存在困難；用藥前后患者的評估、長期隨訪的評價及撤藥原則也缺乏統一標準[3]。以上方法對部分進展期或轉移性病灶效果不佳,因此，有必要提高對乳頭狀甲狀腺癌致癌和發展的分子機制的認識,提高對乳頭狀甲狀腺癌的認識可促進其基因治療的應用，改善患者的預后[4]。探究發病機制尋找治療新靶點對于提高此類癌癥的治療效果具有更加重要的意義。

半乳糖凝集素-3(Galectin-3)是凝集素家族中重要一員，參與多種細胞的生長、凋亡、周期調控、損傷、修復等過程，并且在多種腫瘤組織中均有表達，與腫瘤組織的惡性程度、腫瘤細胞的浸潤、轉移密切相關[5]。本研究采用沉默人甲狀腺乳頭狀癌細胞(Human papillary thyroid carcinoma cells，B-CPAP)的Galectin-3表達，初步探討Galectin-3在B-CPAP增殖、侵襲中的作用。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 B-CPAP細胞株購買于上海拜力生物公司，RPMI-1640培養基購于Gibco北京生物有限公司公司，10 %胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司，小干擾RNA(si-NCAPG)購于上海吉瑪公司，Lipofectamine TM2000試劑盒、MTT試劑盒購于TAKARA大連有限公司；Western blot使用抗體：半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、凋亡抑制基因(Survivin)、基質金屬蛋白酶-9(Matrix metallopeptidase 9,MMP-9)及內參基因(β-actin)單克隆抗體購于Sigma公司，合肥志宏生物技術有限公司銷售。

1.2Galectin-3 siRNA轉染B-CPAP及轉染后細胞中Galectin-3的表達 實驗細胞為對數生長期細胞，在轉染前1 d將細胞濃度調整至1×106個/孔濃度，接種于6孔板中每孔2 mL,當細胞融合度達到50 %左右時按照Lipofection TM 2000試劑盒說明書對空白對照組(Control,僅加入脂質體)、NC-siRNA組(非特異性siRNA，不具有任何干擾作用)、Galectin-3-siRNA1組、Galectin-3-siRNA2組的B-CPAP進行轉染。轉染并進行培養48 h后，收集細胞并檢測各組Galectin-3表達情況，實驗重復3次。

1.3噻唑藍[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide,MTT]法監測Galectin-3-siRNA轉染后B-CPAP增殖情況 將對數生長期細胞接種于96孔板中，每組細胞設置3個復孔，放置培養箱中培養24 h,換液后繼續培養48 h,每孔加入MTT液20 μL繼續放入培養箱中，4 h后取出，棄去上清并每孔加入150 μL DMOS，待細胞完全裂解后，用酶標儀于490 nm檢測每孔的吸光度值，重復實驗3次，取平均值。細胞抑制率(%)=(對照組吸光度值-實驗組吸光度值)/對照組吸光度值×100 %。

1.4Transwell小室測各組細胞侵襲率 按文獻[6]的方式，取Transwell小室，4 ℃預冷，PBS緩沖液(1∶8配置Matrigel膠液)，將100 μL膠液從小室內緩慢注入完成輔膠，37 ℃放置30 min備用。向24孔板中注入含有10 %胎牛血清的培養液600 μL/孔，將小室置入24孔板中同時向小室中加入100 μL細胞混懸液，低氧下繼續培養48 h,除去未穿膜細胞、固定、染色。鏡下隨機讀取10個視野，計算膜背側的穿膜數(侵襲率 = 低氧組穿膜細胞數/常氧組穿膜細胞數 × 100 %)。

1.5Galectin-3-siRNA轉染后檢測B-CPAP中相關蛋白表達情況 取對數期生長細胞接種至96孔板中，每孔200 μL，置入培養箱中24 h,按Lipofection TM 2000試劑盒說明書分組轉染，收集轉染后48 h的細胞(包括加入脂質體的空白對照組)，利用蛋白裂解液將各組細胞裂解，并分組提取蛋白，電泳、轉膜、一抗(Survivin、Bcl-2、MMP-9均按1∶500稀釋)4 ℃過夜、TBST清洗5次，二抗(辣根過氧化物酶HRP標記)37 ℃孵育2 h, 后按Western blot 步驟測化學發光顯影，凝膠成像，通過掃描儀采集條帶，計算灰度值，獨立重復實驗3次。

1.6統計 采用SPSS 22.0統計軟件進行分析，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1沉默B-CPAP中Galectin-3后，B-CPAP中Galectin-3表達水平 通過Western blot檢測后Galectin-3-siRNA1及Galectin-3-siRNA2均可以降低細胞中Galectin-3表達，其中以Galectin-3-siRNA1的效果稍佳，實驗組及陰性對照組對Galectin-3蛋白表達無影響，見圖1。

圖1 Western blot檢測Galectin-3-siRNA后甲狀腺癌細胞Galectin-3表達變化

2.2MTT測沉默B-CPAP中Galectin-3后各組細胞增殖情況 經siRNA Galectin-3后，與空白組及NC-siRNA相比，Galectin-3-siRNA1、Galectin-3-siRNA2這兩組細胞增殖率顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05),見圖2。

圖2 4組細胞增殖率比較

2.3Transwell小室測沉默B-CPAP中Galectin-3后各組細胞侵襲能力 結果如圖3所示，與對照組及陰性組相比Galectin-3-siRNA1及Galectin-3-siRNA2組細胞侵襲能力顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 Galectin-3-siRNA對B-CPAP侵襲能力影響

2.4沉默B-CPAP中Galectin-3后對Bcl-2、Survivin及MMP-9蛋白表達影響 結果發現，沉默Galectin-3后凋亡抑制蛋白Bcl-2、Survivin表達明顯降低，與空白對照組及陰性組相比差異顯著，差異有統計學意義(P<0.05)，同時結果也顯示MMP-9蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4、5。

圖4 各組Survivin及Bcl-2蛋白表達

3 討論

Galectin-3廣泛分布腫瘤細胞內，參與細胞免疫調節及腫瘤增殖、侵襲等過程[5，7]。國內研究[8-9]發現，Galectin-3在多種腫瘤細胞中表達較為顯著且在腫瘤細胞發展、轉移過程中充當了重要的角色。有研究[10]顯示，Galectin-3通過半乳糖苷結合功能調節細胞生長，與乳頭狀甲狀腺癌的發生和轉移有關。Shetty等[11]證實，使用RNA干擾Galectin-3表達后乳腺癌細胞的增殖、侵襲能力均下降，使得癌細胞凋亡增加。有研究[12]發現減少Galectin-3可以抑制卵巢癌增殖、遷移和侵襲，過度表達Galectin-3則產生相反作用，該研究提示Galectin-3可能成為癌癥治療的新靶點。鑒于Galectin-3在腫瘤發生和癌癥進展中的作用，其可作為甲狀腺癌治療潛在的靶點[5、13]。本研究通過探究沉默Galectin-3對B-CPAP的增殖、侵襲能力的影響，結果顯示在B-CPAP中使用siRNA干擾Galectin-3表達后，B-CPAP增殖、侵襲能力明顯下降(P<0.05)，差異有統計學意義，證實通過有效降低Galectin-3表達可以遏制B-CPAP增殖、侵襲能力，與研究結果相一致[11-12]。其也提示Galectin-3可作為甲狀腺癌治療潛在的靶點。

圖5 各組MMP-9蛋白表達

Survivin屬于凋亡抑制蛋白，能夠維持細胞活性，抑制細胞凋亡,在腫瘤細胞的發生、發展過程中發揮重要的作用[14]。Survivin在甲狀腺癌組織和細胞中均呈高表達，提示Survivin在甲狀腺癌細胞的凋亡過程中發揮著重要作用，沉默Survivin表達可通過下調Bcl-2蛋白的表達引起甲狀腺癌細胞凋亡[15]。Bcl-2是Bcl家族中最先發現的抑制細胞凋亡因子，主要通過細胞途徑維持細胞正常增長，遏制細胞凋亡[16]。有研究發現通過抑制Bcl-2降低腫瘤細胞遷移而誘導細胞凋亡[17]。國外研究也發現Galectin-3與Bcl-2有相似的重要序列，且序列的存在與抗細胞凋亡的特征具有很大的相關性[5]。蛋白質-細胞內Galectin-3與Bcl-2蛋白的相互作用可能是Galectin-3抑制癌細胞凋亡的機制之一[18-19]。劉松[20]在甲狀腺癌組織研究中發現Galectin-3基因與Survivin表達呈正相關，提示兩者可能存在協同，但該實驗僅從組織學上推測兩者可能存在相關性，并未從細胞學上進一步來干預Galectin-3基因表達后探究Survivin蛋白表達的變化。本實驗通過siRNA基因抑制Galectin-3表達后，Survivin、Bcl-2表達顯著低于空白對照組及陰性對照組(P<0.05)，差異有統計學意義，即B-CPAP增殖、侵襲能力下降，從而表明Galectin-3在Survivin和Bcl-2使B-CPAP凋亡中的作用是促進的關系，也可能是沉默Galectin-3對B-CPAP增殖和侵襲能力的機制之一。

MMP-9屬于MMP家族，為高度保守的蛋白水解酶，其在癌細胞的轉移潛能中起著重要作用，可以破壞組織屏障細胞外基質，導致腫瘤發生轉移[21]。大量證據表明[22]MMP-9是腫瘤生長、侵襲和轉移的重要調節因子，此研究也發現高危甲狀腺乳頭狀癌患者術前MMP-9水平較高，而那些需要重復劑量的131I治療的患者MMP-9水平較高,故對轉移性及碘難治性分化型甲狀腺癌有指導意義。研究[23]證實MMP-9能促進轉移生長因子誘導甲狀腺癌的上皮-間質轉化過程，MMP-9的高表達可能是影響甲狀腺癌高侵襲性和預后不良的因素之一。有研究報道通過沉默MMP-9高轉移性乳腺癌的侵襲和轉移能力明顯下降，這說明MMP-9過表達可以促進腫瘤細胞的遠處轉移[24]，以上研究均說明MMP-9在多種腫瘤細胞的增殖和侵襲能力過程中發揮重要的作用。楊柳等[25]研究發現在肺癌H460細胞中下調Galectin-3后的H460細胞中MMP-9水平下降，說明下調Galectin-3可能通過抑制肺癌細胞合成MMP-9發揮抗腫瘤作用。有研究表明MMP-9在甲狀腺癌的侵襲和轉移過程中起著重要的作用[26]。方政等[9]通過沉默Galectin-3表達發現口腔鱗狀細胞MMP-9表達低于空白對照組。對于在B-CPAP中，研究沉默Galectin-3表達與MMP-9表達的相關性尚未見文獻報道。本實驗通過沉默Galectin-3表達進一步研究MMP-9蛋白表達的變化，MMP-9蛋白表達顯著低于空白對照組及陰性對照組(P<0.05)，差異有統計學意義，同時B-CPAP增殖及侵襲能力也顯著減弱。與之前實驗相比，從細胞學角度證實可以通過沉默Galectin-3降低MMP-9蛋白表達，從而降低B-CPAP的增殖及侵襲能力。

既往對于Galectin-3與B-CPAP的增殖及侵襲能力的關系研究較少，現有報道僅是限于從甲狀腺癌組織學角度的研究，從細胞學角度對于B-CPAP發生、發展的機制研究鮮有報道。本研究表明，借助于siRNA技術沉默Galectin-3基因表達，可以下調survivin、Bcl-2及MMP-9蛋白表達，B-CPAP增殖率明顯下降，同時細胞侵襲能力也明顯降低，Galectin-3在B-CPAP的發生發展中發揮了重要作用。沉默Galectin-3對B-CPAP增殖和侵襲能力的可能機制是沉默Galectin-3基因，下調了survivin、Bcl-2及MMP-9蛋白表達。本次研究結果也為該疾病，尤其是部分進展期、轉移性病灶或碘難治性分化型甲狀腺癌的未來靶向治療提供可能理論依據。但本研究仍然存在不足之處，僅對沉默Galectin-3基因與survivin、Bcl-2及MMP-9下調的關系進行了簡單的研究，而對于促進腫瘤細胞凋亡方面存在的具體機制尚需進一步深入研究。