基于正交實驗方法的沼澤紅假單胞菌對氨氮去除效果影響因素探究

＊黎菲 韓柱 孟信剛

（景德鎮學院 生物與環境工程學院 江西 333000）

沼澤紅假單胞菌（Rhodop seudomonas palustris）以其無毒、耐受性強、易人工培養、蛋白質含量高、繁殖快、有機物去除率高、低成本等優點被人們重視，而且沼澤紅假單胞菌還屬于我國農業部允許使用的飼料級微生物之一[1-4]，因此作為餌料添加劑被廣泛的應用于水產養殖業中。然而關于沼澤紅假單胞菌在生物脫氮及污水處理方面的研究則較少[5-7]。因此，開展沼澤紅假單胞菌對氨氮去除效果影響因素探究，研究沼澤紅假單胞菌菌株對不同濃度初始氨氮含量的氨氮廢水、不同pH的氨氮廢水以及不同溫度的氨氮廢水中氨氮的降解能力，對該菌株在生物脫氮的開發上具有重要意義[8]。本文通過正交設計實驗室室內模擬實驗，控制影響沼澤紅假單胞菌氨氮降解效率的因素，判斷沼澤紅假單胞菌菌株處理含氨氮廢水的最佳條件，可為菌株投入實際污水處理應用提供數據參考。

1.實驗材料和方法

(1)實驗材料與設備

①實驗菌種：沼澤紅假單胞菌甘油管（Rhodop seudanonas palustris）菌種編號CICC23812（其他編號CGMCC1.2352），購于北京保藏生物中心。

②儀器設備：立式壓力蒸汽滅菌鍋LS-100HD、雙層大容量全溫搖床、V-5000可見分光光度計、PHS-2F pH計、SJCJ-2F超凈工作臺、HH-4數顯恒溫水浴鍋。

③菌種活化培養：酵母提取物2.5g、蛋白胨5g、氯化鈉（NaCl）5g、蒸餾水0.5L，混勻后，調pH為7左右，121℃滅菌25min。

④模擬氨氮廢水的配制：準備提前烘干2h的氯化銨（0.0764g、0.1529g、0.2293g、0.3057g、0.3821g）、七水合硫酸鎂0.1025g、三水合乙酸鈉0.564g、磷酸氫二鉀0.09g、蒸餾水1L，通過控制加入氯化銨的量得到氨氮含量約為20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L的氨氮廢水[9]。

(2)實驗方法

①菌種的活化：A.培養基的配制稱取酵母提取物2.5g、蛋白胨5g、氯化鈉（NaCl）5g于燒杯中，加入蒸餾水0.5L，混勻后，調pH為7左右。轉移至3個250mL的錐形瓶中，用封口膜和棉線繩包好錐形瓶，將包好的錐形瓶放入高壓滅菌鍋，121℃滅菌25min。將冷卻后的培養基轉移至2-8℃的冰箱中冷藏保存。B.接種按照1:100的接種比例將甘油菌接種至配置的菌種活化培養液中使之液體厭氧，放置于25-30℃的光照條件下培養。培養好的菌種可以直接放在陽臺光照保存。

②廢水中氨氮含量的測定方法：均采用現行水質氨氮的測定——納氏試劑分光光度法（HJ 535-2009）[10]。

取8個50mL的容量瓶，按表1加入氨氮工作標準溶液，稀釋，定容至刻度線，混勻，再加入配制好的酒石酸鉀鈉溶液以及納氏試劑（碘化汞-碘化鉀-氫氧化鈉），混勻。先將分光光度計預熱20min，將配制好的容量瓶室溫靜置顯色10min，在波長420nm處，選用10mm比色皿，以蒸餾水做參比，測定吸光度。以空白矯正后的吸光度為縱坐標，其對應的氨氮含量（μg）為橫坐標，繪制標準曲線。

表1 標準曲線繪制方案

③正交實驗優化氨氮降解條件：選取三個對沼澤紅假單胞菌CICC23812降解氨氮效果可能有影響的因素：溫度、pH、初始氨氮濃度。深入研究這三個因素對該菌株降解氨氮能力的影響。實驗中的各因素選取5個實驗水平，每個實驗水平做三組平行實驗，取平均值得到實驗結果。因素水平表見表2。pH通過加入鹽酸或氫氧化鈉進行調節，利用pH計進行測定。溫度通過恒溫水浴鍋控制。

表2 因素水平表

④接種：0.5mL的菌液與9mL的模擬氨氮廢水混合加入10mL的螺口管。

⑤測定接種后混合液中氨氮含量：由于培養沼澤紅假單胞菌的培養液中加入了有機氮源（蛋白胨），故菌株再生長繁殖過程中會消耗有機氮源產生氨氮，因此需要測量菌液中的氨氮濃度，計算得到菌液與模擬氨氮廢水混合而成的混合液中的氨氮含量。使用納氏試劑分光光度法測量得到菌液中氨氮的含量為76.05mg/L。

⑥接菌后廢水的培養：將接種菌液后的混合液放于對應的溫度條件下，光照液體厭氧培養5h后測定培養后水樣的氨氮濃度。

⑦氨氮降解率計算公式：氨氮降解率（%）=（初始氨氮濃度-5h后的氨氮濃度）/初始氨氮濃度×100[7]。

2.結果與分析

(1)標準曲線

根據氨氮含量的測定方法：水質氨氮的測定——納氏試劑分光光度法，測得各組吸光度見表3。得到以空白矯正后的吸光度為縱坐標，其對應的氨氮含量（μg）為橫坐標的標準曲線（圖1）。趨勢線方程為y=0.004x+0.0039，R2為0.991。

表3 標準曲線吸光度

圖1 氨氮含量標準曲線

(2)正交實驗結果

實驗選取沼澤紅假單胞菌降解氨氮過程中的影響因素pH、初始氨氮濃度、溫度三因素來設計正交實驗，正交設計結果見表4。

表4 正交實驗結果

續表

由表4可知最優組合為A5B5C5，由此確定沼澤紅假單胞菌CICC23812最優降解氨氮條件為：pH值為9、初始氨氮濃度為103.05mg/L、溫度為45℃。此外存在9組實驗的氨氮降解率出現負值（分別為實驗1、2、6、7、11、12、16、17、21），基于張曉波等[11]研究者的研究結果，初步判斷可能是由于菌液培養時間未達到菌種說明書中推薦的5-7天，因此菌液中活菌數量較少且含有大量未被菌株利用的有機氮源（蛋白胨），由于有機氮降解時的釋氨作用，菌體對氨氮的降解效果受到明顯抑制，氨氮積累明顯，甚至出現處理后廢水中氨氮的濃度高于處理前的現象。

(3)方差分析表

由方差結果來看（表5），初始氨氮濃度對該菌株降解氨氮能力的影響是顯著的（p＜0.05），這表明相對于其他2個因素，初始氨氮濃度是影響該菌株降解氨氮能力的主要因素。

表5 方差分析表

3.結論

本文通過設計正交實驗探究沼澤紅假單胞菌菌株對氨氮的去除效果，對影響該菌株降解效果三個外部環境因素進行了初步分析。研究結果顯示，沼澤紅假單胞菌降解氨氮能力最優的條件為：pH值為9、初始氨氮濃度為103.05mg/L、溫度為45℃。且該菌株在25-45℃，pH5.0-9.0環境條件下均能去除廢水中的氨氮。此外當體系中含有較高濃度的有機氮源時，菌體去除氨氮的能力下降，氨氮積累明顯，甚至出現處理后廢水中氨氮的濃度高于處理前的現象。并且在本次實驗中相較于溫度、pH而言初始氨氮濃度是影響該菌株降解氨氮能力的主要因素。研究結果還表明該菌株對復雜環境有較強的適應能力，對環境變化的敏感性較差，可用于復雜的污水處理方法中，也可用于處理高濃度氨氮含量的廢水，故該菌株在實際生產應用中的使用范圍較廣。