不同產(chǎn)地三葉青總黃酮及多糖含量的測(cè)定

＊阮明穎

（寧德職業(yè)技術(shù)學(xué)院 福建 355000）

1.引言

中藥的療效決定于其所含有效成分多少。植物的活性成分是其次生代謝的產(chǎn)物，同時(shí)也受初級(jí)代謝水平的影響。不同地區(qū)的氣候、土壤條件等生態(tài)環(huán)境因子通過(guò)影響植物細(xì)胞的新陳代謝，從而影響其次生代謝產(chǎn)物的積累，不同地區(qū)的氣候、土壤條件等生態(tài)環(huán)境因子作為影響中藥材品質(zhì)的一個(gè)主要因素，一直以來(lái)是中藥材質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)研究的重點(diǎn)。研究表明，同一品種藥材，產(chǎn)地不同，則所含有效成分就存在差異，甚至化學(xué)成份的種類及其含量相差較大，臨床療效亦如此。

三葉青藥理作用的研究顯示其總黃酮對(duì)肝癌、肺癌、胃癌和血癌細(xì)胞株具有“促凋亡作用”，多糖對(duì)急性肝損傷具有阻抗作用，然而現(xiàn)有報(bào)道中僅限于少數(shù)幾個(gè)產(chǎn)區(qū)三葉青藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)，且多以總黃酮或少數(shù)幾種黃酮成分為參考指標(biāo)，對(duì)其多糖的測(cè)定研究較少。多項(xiàng)研究表明不同產(chǎn)地三葉青藥材化學(xué)成分及藥理活性差異大，浙江產(chǎn)區(qū)藥材在解熱抑制肝癌細(xì)胞增殖的活性等方面都占有明顯的優(yōu)勢(shì)。鄭軍獻(xiàn)等測(cè)定了不同產(chǎn)地10份三葉青樣品中總黃酮的含量，結(jié)果表明不同產(chǎn)地藥材總黃酮含量差異最大可達(dá)7倍，個(gè)別產(chǎn)區(qū)藥材部分黃酮成分幾乎檢測(cè)不到。

此外，三葉青是多年生植物，其入藥部位地下塊根生長(zhǎng)慢，需要3～5年才能達(dá)到商品藥材的要求，莖葉部分常在根采收后被丟棄，浙江、廣西民間采用三葉青全草入藥，然而目前其化學(xué)與藥理研究主要針對(duì)其塊根提取物，目前三葉青化學(xué)與藥理研究主要針對(duì)其塊根提取物，對(duì)三葉青莖葉化學(xué)成分的研究報(bào)道亦鮮見。為了更加全面地了解不同產(chǎn)地三葉青藥材塊根及莖葉部分的質(zhì)量差異性，收集了全國(guó)17批不同產(chǎn)地的三葉青藥材，采用分光光度法分別測(cè)定了其塊根及莖葉部分的總黃酮和多糖含量，為進(jìn)一步化學(xué)和藥理相關(guān)性研究以及三葉青的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)和參考。

2.實(shí)驗(yàn)部分

(1)主要儀器

SHIMADZU UV-2550紫外分光光度計(jì)；AB204-L電子分析天平（德國(guó)賽多利斯儀器公司）；80-2B離心機(jī)（湖南湘儀器實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；ED-115型恒溫干燥箱（德國(guó)Bingder公司）；Direct-Q 3UV超純水機(jī)；Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀。

(2)材料與試劑

葡萄糖、NaOH、Al(NO3)3、NaNO2、乙醇、濃硫酸、苯酚、氯仿、正丁醇均選用分析醇，國(guó)藥集團(tuán)；蘆丁對(duì)照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：J1430068），水為超純水。

三葉青藥材由浙江省麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供，信息詳見表1。

表1 各產(chǎn)地三葉青信息表

續(xù)表

(3)溶液的制備

①標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液溶液的制備

準(zhǔn)確稱取蘆丁對(duì)照品，加少量50%乙醇微熱溶解，冷卻后定容制成每毫升含蘆丁0.3mg的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

②供試品溶液的制備

取一定質(zhì)量的三葉青樣品切成小塊，置50℃烘箱烘至恒重，記錄恒重值。粉碎后稱取10g的粉末，用茶包袋裝好置于索氏提取器中，加入500ml的50%乙醇提取，提取液經(jīng)4000rpm離心10min，留取上清液用作黃酮含量檢測(cè)。待乙醇揮干后用水提取多糖，用于多糖含量測(cè)定。

(4)總黃酮測(cè)定方法

①顯色方法及測(cè)定方法的優(yōu)化

總黃酮的測(cè)定選用蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行可行性分析，如圖1所示，實(shí)際樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均在同一波長(zhǎng)處出現(xiàn)響應(yīng)。

圖1 三葉青黃酮提取液和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的顯色吸光度-波長(zhǎng)曲線

總黃酮顯色方法：在中性或弱堿性及亞硝酸鈉中，黃酮類化合物與鋁鹽生產(chǎn)螯合物，加入氫氧化鈉溶液后顯紅橙色，在400～800nm波長(zhǎng)處掃描，對(duì)照品與樣品紫外吸收基本一致，最大吸收波長(zhǎng)為500nm，故選500nm為比色測(cè)定波長(zhǎng)。具體方法參考文獻(xiàn)[9]的測(cè)定方法，并對(duì)黃酮檢測(cè)方法中顯色劑5% NaNO2、10% Al(NO3)3和4% NaOH的用量進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化。圖2、圖3和圖4為優(yōu)化曲線圖。如圖：5% NaNO2、10%Al(NO3)3和4% NaOH的最佳用量分別為300μl、300μl和4ml。

圖2 5%亞硝酸鈉體積-吸光度曲線

圖3 10%硝酸鋁體積-吸光度曲線

圖4 4%氫氧化鈉體積-吸光度曲線

經(jīng)優(yōu)化后總黃酮測(cè)定方法如下：精密吸取對(duì)照品或供試品溶液各2ml置比色管中，加入300μl 5% NaNO2靜置6min后再加入300μl 10% Al(NO3)3再靜置6min隨后加入4ml 4% NaOH并用無(wú)水乙醇定容至10ml，搖勻后放置30min至顯色穩(wěn)定，即得對(duì)照品顯色溶液及供試品顯色溶液。分別以同樣處理的空白顯色體系為對(duì)照，測(cè)定500nm波長(zhǎng)處的吸光度。

②標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

依據(jù)上面的優(yōu)化后條件取不同體積的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用分光光度計(jì)在500nm處測(cè)定其光密度值，以光密度值為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5所示。建立的黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=6.91911x+0.00176（r2=0.99998）（n=3）。

圖5 蘆丁-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

③顯色穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取蘆丁對(duì)照品和供試溶液各2.0ml，按“2.4.1”項(xiàng)方法操作，在0min，15min，30min，45min，60min，75min測(cè)定吸光度，結(jié)果表明，不論是對(duì)照品還是樣品顯色產(chǎn)物在室溫下吸光度值均穩(wěn)定，RSD為0.17%，說(shuō)明此方法在75min內(nèi)穩(wěn)定。

④精密度試驗(yàn)

精密量取蘆丁對(duì)照品和供試溶液各2.0ml，按“2.4.1”項(xiàng)方法，反復(fù)操作6次，RSD為0.27%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

⑤重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取蘆丁對(duì)照品和供試溶液各2.0ml，按“2.4.1”項(xiàng)方法，反復(fù)操作6次，RSD為0.64%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

⑥回收率試驗(yàn)

取1.0g的三葉青葉進(jìn)行黃酮提取，提取液定容至250ml，測(cè)得黃酮含量為17.6mg/g。分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表一所示。加標(biāo)回收率均高達(dá)99.45%，這說(shuō)明此實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)方法具有很好的可靠性（表2）。

表2 三葉青葉黃酮加標(biāo)回收率

(5)多糖含量測(cè)定方法

①三葉青多糖提取液脫蛋白

由于蛋白質(zhì)的存在對(duì)多糖的檢測(cè)存在較大的干擾，因此為了得到可靠的多糖數(shù)據(jù)有必要對(duì)多糖提取液進(jìn)行脫蛋白處理。用脫蛋白試劑Sevage脫蛋白試劑（氯仿:正丁醇=4:1）。脫蛋白完全標(biāo)準(zhǔn)為280nm處吸光度達(dá)到平衡。如圖6所示，在多糖提取液與Sevage脫蛋白試劑體積比為4:1條件下脫蛋白在30min左右即可完成。因此在之后的脫蛋白時(shí)間選擇為30min。

圖6 三葉青不同部位多糖提取液脫蛋白吸光度-時(shí)間曲線

②顯色方法及測(cè)定方法的優(yōu)化

多糖的測(cè)定選用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行可行性分析，如圖7所示，實(shí)際樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均在同一波長(zhǎng)處出現(xiàn)響應(yīng)。

圖7 三葉青多糖提取液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的顯色吸光度-波長(zhǎng)曲線

多糖顯色方法：硫酸的作用下，多糖水解成單糖，而后迅速脫水生成糖醛衍生物，與苯酚生成橙黃色化合物，在波長(zhǎng)489nm處一定濃度范圍內(nèi)其吸光度與濃度有線性關(guān)系，489nm為比色測(cè)定波長(zhǎng)。并對(duì)檢測(cè)方法中苯酚、濃硫酸的用量進(jìn)行優(yōu)化。圖8和圖9為優(yōu)化曲線圖。如圖可知5%苯酚和濃硫酸的最佳用量分別為3ml和8ml。

圖8 5%苯酚體積-吸光度曲線

圖9 濃硫酸體積-吸光度曲線

經(jīng)優(yōu)化后多糖測(cè)定方法如下：取1ml的多糖提取液于比色管中，加入3ml 5%苯酚和8ml濃硫酸并劇烈震蕩，震蕩后于沸水浴中反應(yīng)1h。取出冷卻，30min后檢測(cè)489nm處吸光度。分別以空白顯色體系為對(duì)照。

③標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

依據(jù)上面的優(yōu)化后條件取不同體積的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用分光光度計(jì)在489nm處測(cè)定其光密度值。以光密度值為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖10所示。建立的多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=47.0249x+0.01192（r2=0.99967）（n=3）。

圖10 葡萄糖-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

④顯色穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取葡萄糖對(duì)照品和供試溶液各1.0ml，按“2.5.2”項(xiàng)方法操作，在0min，15min，30min，45min，60min，75min測(cè)定吸光度，結(jié)果表明，對(duì)照品和樣品顯色產(chǎn)物在室溫下吸光度值穩(wěn)定，RSD為0.28%，說(shuō)明此方法在75min內(nèi)穩(wěn)定。

⑤精密度試驗(yàn)

精密量取葡萄糖對(duì)照品和供試溶液各1.0ml，按“2.5.2”項(xiàng)方法，重復(fù)操作6次，RSD為0.29%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

⑥重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取葡萄糖對(duì)照品和供試溶液各1.0ml，按“2.5.2”項(xiàng)方法，重復(fù)操作6次，RSD為0.34%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

⑦回收率試驗(yàn)

取1.0g的三葉青葉進(jìn)行多糖提取，提取液定容至250ml，測(cè)得多糖含量為45.2mg/g。分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表一所示。加標(biāo)回收率均高達(dá)99.4%，這說(shuō)明此實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)方法具有較好的可靠性（表3）。

表3 三葉青葉多糖加標(biāo)回收率

(6)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用X±SD表示，多個(gè)組間均值比較選用one-way ANOVA分析以及LSD兩兩比較。其中，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.結(jié)果

(1)不同產(chǎn)地三葉青莖葉及塊根中總黃酮含量

不同產(chǎn)地三葉青莖葉及塊根中總黃酮含量的測(cè)定結(jié)果見表4。結(jié)果表明，17批三葉青樣品總黃酮含量在3.9±0.5mg/g～46.9±3.8mg/g之間，平均含量為23.3mg/g；其中三葉青莖葉總黃酮平均含量為23.7mg/g，塊根總黃酮平均含量為22.8mg/g。總黃酮含量在不同產(chǎn)地、相同產(chǎn)地不同部分的樣品間均存在顯著的差異（P＜0.05）。

表4 各產(chǎn)地三葉青莖葉及塊根中總黃酮、多糖含量測(cè)定結(jié)果(X±SD，n=3)

續(xù)表

不同產(chǎn)區(qū)莖葉部分總黃酮含量，以浙江麗水（8號(hào)）產(chǎn)區(qū)的最高為46.9±3.8mg/g，高出平均含量的101.5%；以云南呈貢（2號(hào)）產(chǎn)區(qū)的含量最低為3.9±0.5mg/g，低于平均含量的83.2%。總的來(lái)說(shuō)，浙江產(chǎn)區(qū)7個(gè)產(chǎn)地樣品的總黃酮含量普遍高于其它產(chǎn)區(qū)，平均值為34.5mg/g，與其它產(chǎn)區(qū)差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。而湖北、貴州、云南和重慶4個(gè)西南產(chǎn)區(qū)樣品的總黃酮含量則普遍低于其它產(chǎn)區(qū)，平均值為7.1mg/g，與其它產(chǎn)區(qū)差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

不同產(chǎn)區(qū)塊根部分總黃酮含量，以廣西田林（17號(hào)）產(chǎn)區(qū)的最高為40.1±3.9mg/g，高出平均含量的72.3%；以云南呈貢（2號(hào)）產(chǎn)區(qū)的含量最低為7.9±0.9mg/g，低于平均含量的66.1%。總的來(lái)說(shuō)，廣西和江西產(chǎn)區(qū)4個(gè)產(chǎn)地樣品的總黃酮含量普遍高于其它產(chǎn)區(qū)，平均值為37.2mg/g，與其它產(chǎn)區(qū)差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。而湖北、貴州、云南和重慶4個(gè)西南產(chǎn)區(qū)樣品的總黃酮含量則普遍低于其它產(chǎn)區(qū)，平均值為9.9mg/g，與其它產(chǎn)區(qū)差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

(2)不同產(chǎn)地三葉青莖葉及塊根中多糖含量

不同產(chǎn)地三葉青莖葉及塊根中多糖含量的測(cè)定結(jié)果見表4。結(jié)果表明，17批三葉青樣品多糖含量在16.7±2.1mg/g-63.2±5.8mg/g之間，平均含量為39.9mg/g；其中三葉青莖葉多糖平均含量為33.9mg/g，塊根多糖平均含量為45.9mg/g。多糖含量在不同產(chǎn)地、相同產(chǎn)地不同部分的樣品間均存在顯著的差異（P＜0.05）。

不同產(chǎn)區(qū)莖葉部分多糖含量，以浙江慶元（12號(hào)）產(chǎn)區(qū)的最高為49.5±5.1mg/g，高出平均含量的24.1%；以云南呈貢（2號(hào)）產(chǎn)區(qū)的含量最低為16.7±2.1mg/g，低于平均含量的58.1%。總的來(lái)說(shuō)，浙江、福建和江西產(chǎn)區(qū)樣品的多糖含量普遍高于其它產(chǎn)區(qū)，平均值為43.6mg/g，與其它產(chǎn)區(qū)差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。而湖北、貴州、云南和重慶等產(chǎn)區(qū)樣品的多糖含量則普遍低于其它產(chǎn)區(qū)，平均值為20.3mg/g，與其它產(chǎn)區(qū)差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

不同產(chǎn)區(qū)塊根部分多糖含量，以浙江麗水（8號(hào)）產(chǎn)區(qū)的最高為63.2±5.8mg/g，高出平均含量的58.4%；以廣西樂業(yè)（13號(hào)）產(chǎn)區(qū)的含量最低為25.6±3.1mg/g，低于平均含量的35.8%。總的來(lái)說(shuō)，浙江、福建和江西產(chǎn)區(qū)樣品的多糖含量普遍高于其它產(chǎn)區(qū)，平均值為57.6mg/g，與其它產(chǎn)區(qū)差異達(dá)顯著水平（P＜0.0）。而湖北、貴州、云南和重慶等產(chǎn)區(qū)樣品的多糖含量則普遍低于其它產(chǎn)區(qū)，平均值為29.2mg/g，與其它產(chǎn)區(qū)差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

4.討論

藥用植物的品質(zhì)受到其生長(zhǎng)過(guò)程中各內(nèi)外因素的影響。“離其本土，則質(zhì)同而效異”充分反應(yīng)了產(chǎn)地與質(zhì)量之間的關(guān)系。由于地理分布不同，各地區(qū)的土壤、氣溫、水質(zhì)、雨量等生態(tài)因子差別很大，使得藥用植物特定的基因型在不同的生態(tài)環(huán)境下受到復(fù)雜的調(diào)控，從而導(dǎo)致次生代謝調(diào)控關(guān)鍵酶基因的時(shí)空差異表達(dá)。另一方面，土壤中一些明顯參與其生物活性成分合成的微量元素等物質(zhì)，也能顯著影響藥用植物藥效成分的質(zhì)與量。

三葉青黃酮及多糖為其藥理活性物質(zhì)，然而多項(xiàng)研究表明藥材市場(chǎng)上三葉青種質(zhì)混雜，化學(xué)成分及藥理活性差異大，例如：鄭軍獻(xiàn)等采用分光光度法測(cè)定了浙江和廣西產(chǎn)地10份三葉青樣品中總黃酮的含量，結(jié)果顯示不同產(chǎn)地藥材黃酮含量差異最大可達(dá)7倍。許文等采用UPLC-MS/MS定量分析測(cè)定30批不同產(chǎn)地三葉青中10種黃酮類成分結(jié)果表明，各類成分含量差異懸殊，甚至有些批次中未檢測(cè)出。本次研究結(jié)果顯示，浙江麗水產(chǎn)區(qū)與云南呈貢產(chǎn)區(qū)的三葉青總黃酮含量差異超過(guò)10倍。浙江慶元產(chǎn)區(qū)與云南呈貢產(chǎn)區(qū)的三葉青多糖含量差異超過(guò)3倍。綜合總黃酮及多糖含量2項(xiàng)指標(biāo)來(lái)看，浙江、福建和江西產(chǎn)區(qū)三葉青藥材品質(zhì)較好，而湖北、貴州、云南和重慶等產(chǎn)區(qū)藥材品質(zhì)較低。各地三葉青生長(zhǎng)地域界限分明，生長(zhǎng)習(xí)性和藥材品質(zhì)有較大差異。三葉青入藥部位多為地下塊根，浙江、廣西民間有部分地區(qū)采用三葉青全草入藥，然而目前三葉青莖葉化學(xué)與藥理研究報(bào)道較為罕見。本研究還顯示黃酮及多糖在莖葉部分含量也較高，其中浙江產(chǎn)區(qū)三葉青樣品莖葉部分總黃酮含量甚至顯著高于塊根部分，具有潛在的開發(fā)利用價(jià)值，尚有待其藥理學(xué)活性的深入研究以進(jìn)一步明確三葉青莖葉的藥用價(jià)值，為擴(kuò)大其資源利用提供科學(xué)依據(jù)和指導(dǎo)。

三葉青具有多種藥效功能，然而目前其藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分尚未明確，僅以總黃酮或少數(shù)幾種黃酮成分作為三葉青藥理作用研究和藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)為參考指標(biāo)是不全面的，有待進(jìn)一步深入研究其化學(xué)成分和藥理作用，以更全面的規(guī)范三葉青藥材模式識(shí)別方法和質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。