基于聚（N-異丙基丙烯酰胺）的溫度響應(yīng)型可注射水凝膠的制備及其性能研究

＊潘穗萍 陶倩 王怡婷

（魯東大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 山東 264025）

水凝膠通常是柔軟的固體材料，具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)絡(luò)中的孔隙使得水凝膠能夠保存大量的溶液，有利于傳遞和運(yùn)輸生物分子、營養(yǎng)物質(zhì)以及細(xì)胞生理活動(dòng)過程中的代謝廢物。然而預(yù)制成型的水凝膠在組織工程應(yīng)用中會(huì)遇到很多問題，如手術(shù)過程復(fù)雜、創(chuàng)傷面積較大、凝膠形狀不能與缺損處完全吻合等。可注射凝膠可以有效避免這些問題，因?yàn)樗谶M(jìn)入人體之前處于低粘度的流體狀態(tài)，進(jìn)入人體之后通過某種物理或化學(xué)變化快速原位轉(zhuǎn)變?yōu)榉橇鲃?dòng)的凝膠狀態(tài)[1-2]。目前已經(jīng)報(bào)道了多種基于不同機(jī)理的可注射凝膠[3-4]，其中利用手術(shù)環(huán)境和人體的溫度差異設(shè)計(jì)出來的溫度響應(yīng)型水凝膠因其組分簡單、安全低毒、操作簡便等優(yōu)勢(shì)而備受矚目[5-6]。

溫度響應(yīng)型材料的研究和發(fā)展比較廣泛，其中的典型代表是聚（N-異丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm），它的最低臨界溫度（LCST）接近且略低于人體體溫，在37℃環(huán)境中能夠快速發(fā)生相轉(zhuǎn)變[7]。然而僅依靠PNIPAAm并不能構(gòu)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)其力學(xué)性能和其它功能也難以調(diào)控和擴(kuò)展。因而本文采用天然聚合物殼聚糖（CS）作為可注射水凝膠的結(jié)構(gòu)主體[8]，通過自由基聚合的方法在殼聚糖分子上引入PNIPAAm鏈段，以期能夠制備出具有良好力學(xué)性能和藥物傳遞功能的溫度響應(yīng)型可注射水凝膠。

1.實(shí)驗(yàn)部分

(1)試劑與儀器

殼聚糖（CS，脫乙酰度≥95%）購于上海阿拉丁試劑有限公司；N-異丙基丙烯酰胺（NIPAAm，98%）購于上海麥克林生物有限公司；四甲基乙二胺（TEMED，≥99.5%）購于上海阿拉丁試劑有限公司；過硫酸銨（APS，分析純）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸阿霉素（DOX，98%）購于上海麥克林生物有限公司。

核磁共振波譜儀（AVANCE NEO，瑞士布魯克）用于測(cè)試產(chǎn)物結(jié)構(gòu)；旋轉(zhuǎn)流變儀（DHR-2，美國TA）用于測(cè)試樣品的多種流變性能；紫外可見分光光度計(jì)（T6新世紀(jì)，北京普析通用）用于測(cè)試載藥釋藥實(shí)驗(yàn)中的藥物濃度。

(2)殼聚糖/聚(N-異丙基丙烯酰胺)(CS/PNIPAAm)的制備

準(zhǔn)確稱取殼聚糖和NIPAAm（兩者的質(zhì)量和為0.5g，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為不同的配比），共同溶于10mL 1%的乙酸溶液中。伴隨著電磁攪拌，依次滴加NIPAAm質(zhì)量0.45倍的TEMED和0.3倍的APS，分別作為催化劑和引發(fā)劑。將反應(yīng)體系密封后在25℃繼續(xù)反應(yīng)24h。將反應(yīng)產(chǎn)物移入透析袋中，用去離子水透析三天以純化，之后冷凍干燥得到固體樣品。稱取少量樣品溶于氘代水后用于核磁共振測(cè)試。

(3)溫度響應(yīng)性能測(cè)試

配制濃度為5%的CS/PNIPAAm水溶液，靜置24h以達(dá)到完全溶解狀態(tài)。然后放入37℃的恒溫水浴中，觀察其在室溫和37℃時(shí)的狀態(tài)變化。

(4)流變性能測(cè)試

使用旋轉(zhuǎn)流變儀對(duì)上述濃度為5%的CS/PNIPAAm水溶液進(jìn)行多項(xiàng)測(cè)試。固定溫度為37℃，應(yīng)變?yōu)?%，在頻率0.1～100rad/s范圍內(nèi)進(jìn)行了頻率掃描；固定溫度為37℃，頻率為1rad/s，在應(yīng)變0.1%～10000%范圍內(nèi)進(jìn)行了應(yīng)變掃描。

(5)載藥和釋藥實(shí)驗(yàn)

載藥：取0.5g CS/PNIPAAm，按照投藥比m（DOX）:m（CS/PNIPAAm）=1%、2%和3%分別加入DOX與1mL磷酸緩沖溶液（PBS，pH=7.5），充分溶解后將所得樣品標(biāo)注為DOX@CS/PNIPAAm。

釋藥：將多組DOX@CS/PNIPAAm樣品放入37℃的恒溫?fù)u床中，待轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)后，加入8mL PBS緩沖溶液。分別在1h、2h、3h、4h、8h、12h、24h和36h后取樣并測(cè)試釋放到PBS中的DOX濃度。每次取樣3mL，并同時(shí)補(bǔ)充等量的新鮮PBS緩沖溶液。DOX濃度是利用紫外可見分光光度計(jì)在495nm處根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定。

2.結(jié)果與討論

(1)CS/PNIPAAm的結(jié)構(gòu)鑒定與溫度響應(yīng)性能

CS/PNIPAAm的合成是通過自由基聚合實(shí)現(xiàn)的。在這個(gè)過程中，不僅是NIPAAm單體自身發(fā)生聚合反應(yīng)，同時(shí)也會(huì)與殼聚糖上的氨基鍵合在一起，形成殼聚糖分子的主鏈接枝PNIPAAm鏈段的結(jié)構(gòu)[9]。在CS/PNIPAAm的1H核磁共振譜中可以找到殼聚糖羥基的吸收峰（δ=3.90ppm）和PNIPAAm上異丙基的吸收峰位置（δ=1.15ppm），這表明殼聚糖與NIPAAm的聚合反應(yīng)是成功的（圖1）。

圖1 CS/PNIPAAm的1H核磁共振譜

CS/PNIPAAm的溫度響應(yīng)性能可以直接觀察到，溶解后的CS/PNIPAAm室溫時(shí)是透明可流動(dòng)的溶液狀態(tài)（圖2左），當(dāng)置于37℃水浴中后很快就形成了不透明不能流動(dòng)的凝膠狀態(tài)（圖2右）。而且這個(gè)轉(zhuǎn)變是可逆的，當(dāng)樣品在室溫中冷卻一段時(shí)間后又可以恢復(fù)到透明可流動(dòng)的溶液狀態(tài)。這是因?yàn)镻NIPAAm分子鏈中含有疏水的異丙基和親水的酰胺基，當(dāng)溫度低于其LCST時(shí)，由于酰胺基和水形成氫鍵，PNIPAAm鏈段在水中的溶解度高，分子鏈呈現(xiàn)伸展或者水合線圈構(gòu)象；當(dāng)溫度高于LCST時(shí)，氫鍵被破壞，PNIPAAm鏈段收縮團(tuán)聚。接枝在不同殼聚糖分子上的PNIPAAm彼此聚集，起到了物理交聯(lián)CS/PNIPAAm分子的作用，因而形成了具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。

圖2 CS/PNIPAAm的溶液-凝膠可逆轉(zhuǎn)變（左圖：室溫，右圖：37℃）

(2)CS/PNIPAAm的流變性能

從頻率掃描測(cè)試的結(jié)果中可以看出，在整個(gè)頻率范圍內(nèi)儲(chǔ)能模量（G’）大于損耗模量(G”)，這表明37℃時(shí)CS/PNIPAAm始終能保持住它的交聯(lián)結(jié)構(gòu)（圖3）。隨著頻率的增加，G’和G”都在增加，這是因?yàn)镃S/PNIPAAm的交聯(lián)作用并非是分子間的共價(jià)鍵構(gòu)成，而是一種物理交聯(lián)作用。比較兩圖可知，NIPAAm含量較多的水凝膠體系的G’和G”均較大，意味著更高的力學(xué)強(qiáng)度，這是因?yàn)镹IPAAm組分的增加為水凝膠結(jié)構(gòu)帶來了更大的交聯(lián)密度。此外還可以觀察到體系的復(fù)合黏度η隨著頻率的增大而逐漸減小，這里的頻率和剪切速率正相關(guān)，因此這種黏度變化驗(yàn)證了CS/PNIPAAm水凝膠具有剪切變稀的性質(zhì)，這是設(shè)計(jì)可注射水凝膠的重要特點(diǎn)[10]。

圖3 兩種CS/PNIPAAm水凝膠的頻率掃描測(cè)試，CS和NIPAAm的質(zhì)量比分別為1:6（a）和1:9（b）

應(yīng)變掃描測(cè)試的曲線分為明顯的兩個(gè)部分（圖4）。當(dāng)應(yīng)變較小時(shí)，G’維持在一個(gè)較為穩(wěn)定的值并且始終大于G”，這說明在此范圍內(nèi)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)得以穩(wěn)定保持。隨著應(yīng)變的繼續(xù)增大，G’和G”均下降，但G’的下降速度更快，最終小于G”，說明此時(shí)水凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)已經(jīng)遭到了破壞。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，NIPAAm含量較多的水凝膠體系的屈服應(yīng)變更大，表明了其具有更高的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度。結(jié)合上文所述頻率掃描的測(cè)試結(jié)果，可以考慮通過改變NIPPAm含量來調(diào)控可注射水凝膠的力學(xué)性能。

圖4 兩種CS/PNIPAAm水凝膠的應(yīng)變掃描測(cè)試，CS和NIPAAm的質(zhì)量比分別為1:6（a）和1:9（b）

(3)CS/PNIPAAm的釋藥行為

六組釋藥實(shí)驗(yàn)完成后，統(tǒng)計(jì)每次取樣時(shí)的累計(jì)藥物釋放量，并繪制出其隨時(shí)間變化的曲線，如圖5所示。可以看出所有負(fù)載了DOX的CS/PNIPAAm水凝膠初期釋放速度較快，隨后發(fā)生不同程度的減速，最終20h后趨于穩(wěn)定，具有一定的緩釋效果。總體來看，累計(jì)釋放量隨投藥比的增大而增大，且大部分樣品最大釋放量可達(dá)75%～90%。此外，NIPAAm含量較多的樣品其累積釋放量大于NIPAAm含量較少的，這可能是因?yàn)楦嗟腘IPAAm造成了37℃時(shí)更高的交聯(lián)密度，CS/PNIPAAm分子間的聚集和塌縮更嚴(yán)重，所以藥物小分子更容易從凝膠孔隙中被擠出，導(dǎo)致了更快的釋藥速度和更大的累計(jì)釋放量。

圖5 DOX@CS/PNIPAAm的累計(jì)藥物釋放曲線（CS和NIPAAm的質(zhì)量比為1:6或1:9，投藥比為1%或2%或3%）

3.結(jié)論

本文通過自由基聚合成功制備了CS/PNIPAAm共聚物，將其溶解后可實(shí)現(xiàn)溫度響應(yīng)可逆的溶液-凝膠轉(zhuǎn)變，這一特性賦予了它作為可注射凝膠的重要應(yīng)用前景。流變測(cè)試結(jié)果表明這種可注射水凝膠具有良好的力學(xué)性能，并且可以根據(jù)不同的應(yīng)用場(chǎng)景，通過改變?cè)辖M分中NIPPAm的含量來調(diào)控其力學(xué)性能。同時(shí)，CS/PNIPAAm水凝膠可以方便地負(fù)載藥物并對(duì)其進(jìn)行緩慢釋放。此類水凝膠有望在組織工程、體內(nèi)支架、藥物傳遞等領(lǐng)域得以應(yīng)用。