紫甘薯新品種福寧紫4號(hào)和5號(hào)脫毒種苗繁育

林叢發(fā) 蔣元斌 郭慧慧 潘祥華 謝 星 徐紹翔 羅江鴻

（寧德市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 福建福安 355003）

甘薯是無(wú)性繁殖作物，田間種植容易受病毒侵染，病毒可通過(guò)薯塊和薯苗傳播，導(dǎo)致品種退化，產(chǎn)量下降。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上每年甘薯因病毒病造成的損失在30%～50%，中國(guó)每年因甘薯病毒病造成的損失達(dá)40億元[1-2]。福建7個(gè)甘薯產(chǎn)區(qū)的甘薯病毒病危害程度不同，發(fā)病率在5%～95%[3]。由于福建省甘薯病毒病類(lèi)型多樣化，多為復(fù)合侵染，病毒種類(lèi)及流行株系已發(fā)生新的變化，遺傳結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)多樣化，而病毒變異速率加快，增大了甘薯病毒病的防控難度[3]。因目前尚無(wú)病毒抗性品種，也無(wú)治療植物病毒的特效藥，采用莖尖培養(yǎng)方法培育脫毒薯苗仍然是防治甘薯病毒病、恢復(fù)優(yōu)良種性、提高產(chǎn)量的最有效方法[4-5]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于甘薯莖尖分生組織培養(yǎng)已有報(bào)道，有關(guān)培養(yǎng)條件、結(jié)果各異[4-8]。本試驗(yàn)旨在通過(guò)探討福寧紫4號(hào)和5號(hào)莖尖離體培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生脫毒苗和田間脫毒種薯的繁殖試驗(yàn)，建立福寧紫4號(hào)和5號(hào)脫毒種苗繁育技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

寧德市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所2015年選育的甘薯新品種福寧紫4號(hào)，是以福薯13號(hào)為母本集團(tuán)雜交選育而成；2016年選育的甘薯新品種福寧紫5號(hào)，其品種來(lái)源為龍薯14號(hào)（母本）×金山679（父本）雜交后代。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料采集與消毒2018年6月剪取福寧紫4號(hào)和5號(hào)田間薯苗頂梢3～4節(jié)，用刀片切取側(cè)芽，自來(lái)水沖洗1 h，取出無(wú)菌濾紙吸干水分后，經(jīng)75%酒精浸30 s，無(wú)菌水沖洗2次，再用0.1%升汞消毒8 min，最后用無(wú)菌水沖洗5～6次，備用。

1.2.2 莖尖離體培養(yǎng)在解剖鏡下，將消毒后的福寧紫4號(hào)和5號(hào)側(cè)芽用注射器針尖剝?nèi)ネ鈱尤~片，切取0.1～0.2 mm大小的莖尖接種在不同激素組合的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（表1），各培養(yǎng)基均加蔗糖30 g/L、瓊脂粉4.5 g/L，pH 5.8～6.0（下同）。每種培養(yǎng)基接種8個(gè)莖尖，重復(fù)3次，溫度28～30℃，光照時(shí)間12 h/d，光照度2 000 lx條件下培養(yǎng)，60 d后觀(guān)察統(tǒng)計(jì)成苗率（出苗數(shù)/莖尖接種數(shù)）[9-10]。

1.3 莖尖苗脫毒效果檢測(cè)

每個(gè)莖尖組培苗為一個(gè)無(wú)性系并編號(hào)，繁殖數(shù)量達(dá)到10株，株高在5～6 cm時(shí)，隨機(jī)取其中的5株進(jìn)行檢測(cè)。采用指示植物針刺汁液沾接法[11]，在巴西牽牛初生健康葉上，用滅菌注射器刺孔，然后將每個(gè)待測(cè)莖尖苗無(wú)性系苗5株包扎在一起，擠出汁液，涂抹于針刺孔上，每個(gè)無(wú)性系樣品接種3株巴西牽牛，做好與瓶苗同樣的編號(hào)，并以無(wú)菌水及已知帶毒薯液各接種6株作陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，置于30～33℃防蟲(chóng)網(wǎng)大棚內(nèi)培養(yǎng)。接種后3～20 d連續(xù)觀(guān)察記載癥狀。根據(jù)指示植物癥狀，確定病毒有無(wú)。在所有沾接的指示植物中只要有一株表現(xiàn)典型癥狀（新生葉出現(xiàn)系統(tǒng)性明脈、黃脈，以后發(fā)展為花葉或皺縮等癥狀），則該對(duì)應(yīng)編號(hào)的莖尖組培瓶苗樣品即為病毒陽(yáng)性。根據(jù)田間檢測(cè)結(jié)果淘汰實(shí)驗(yàn)室內(nèi)帶毒瓶苗，保留脫毒瓶苗。

1.4 莖尖脫毒苗繁殖

當(dāng)莖尖脫毒組培瓶苗長(zhǎng)至4～8節(jié)時(shí)，每株棄葉切成帶1個(gè)腋芽的莖段，接種在以下2種培養(yǎng)基上：①M(fèi)S基本培養(yǎng)基；②1/2MS基本培養(yǎng)基（大量、微量元素減半）。每處理3次重復(fù)，每次重復(fù)20個(gè)莖段。培養(yǎng)條件：光照時(shí)間12 h/d，光照度4 000 lx，溫度28℃。觀(guān)察植株生根時(shí)間，60 d后統(tǒng)計(jì)每株苗生長(zhǎng)的莖節(jié)數(shù)。

1.5 煉苗移栽及一級(jí)脫毒種薯生產(chǎn)

1.5.1 煉苗移栽福寧紫4號(hào)和5號(hào)脫毒組培瓶苗經(jīng)多次轉(zhuǎn)代增殖培養(yǎng)，數(shù)量較多時(shí)，留幾瓶作母種擴(kuò)繁外，其余則用于一級(jí)脫毒種薯的繁殖生產(chǎn)。2019年2月下旬，在四周遮蓋40目防蟲(chóng)網(wǎng)的溫控大棚內(nèi)，自然光下遮陽(yáng)50%，瓶苗閉瓶煉苗14～21 d，再開(kāi)瓶煉苗2～3 d后洗凈組培苗根部培養(yǎng)基，定植于溫控大棚苗床上，保濕培養(yǎng)，定期施肥，當(dāng)脫毒苗長(zhǎng)至4～5節(jié)時(shí)，可反復(fù)進(jìn)行剪蔓（每段含2節(jié)）扦插繁殖[12]。

1.5.2 一級(jí)種薯生產(chǎn)2019年6月選用新地或稻田輪作地塊，提前搭建防蟲(chóng)網(wǎng)薄膜大棚。7月上旬深翻整畦，土壤用50%氯溴異氰尿酸和綠氰·毒死蜱進(jìn)行消毒和殺蟲(chóng)，將苗床脫毒苗莖蔓剪成2～3節(jié)扦插于畦內(nèi)，株行距為30 cm×40 cm，澆水，定期施肥，噴藥預(yù)防蚜蟲(chóng)傳播病毒。收獲后分級(jí)儲(chǔ)存作為次年種薯。

1.6 脫毒種薯田間測(cè)產(chǎn)

2020年1月下旬，將未脫毒原品種和脫毒種薯植入50%氯溴異氰尿酸800倍液消毒過(guò)的大棚苗床催芽，6月上旬待苗長(zhǎng)至5～8節(jié)時(shí)剪成3節(jié)長(zhǎng)的莖段扦插于試驗(yàn)小區(qū)，小區(qū)也用該消毒液消毒，株行距為30 cm×70 cm，扦插后每畝澆施5 kg復(fù)合肥（基肥），10 d后施尿素5 kg（點(diǎn)穴肥，即苗肥），35 d后結(jié)合除草施30 kg復(fù)合肥（夾邊肥，即追肥）[13]。田間試驗(yàn)設(shè)置福寧紫4號(hào)和5號(hào)脫毒種薯和原品種(非脫毒種薯苗，即對(duì)照CK)4個(gè)處理，3次重復(fù)，共12個(gè)小區(qū)，每小區(qū)面積14 m2，種67株苗，區(qū)組隨機(jī)排列，四周留保護(hù)行。11月下旬收獲時(shí)測(cè)定各小區(qū)產(chǎn)量。

1.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

采用DPS 7.05統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行Duncan新復(fù)極差檢驗(yàn)顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖尖離體培養(yǎng)結(jié)果

方差分析結(jié)果表明（表1），2個(gè)紫甘薯新品種對(duì)莖尖成苗率無(wú)顯著影響。6-BA所試的3個(gè)水平濃度對(duì)福寧紫5號(hào)成苗率影響達(dá)極顯著差異，NAA 0.01 mg/L、0.02 mg/L水平濃度對(duì)成苗率影響無(wú)顯著差異，NAA 0.02 mg/L、0.05 mg/L水平濃度對(duì)成苗率影響無(wú)顯著差異，但NAA 0.01 mg/L、0.05 mg/L水平濃度對(duì)成苗率影響達(dá)顯著差異。可見(jiàn)，6-BA是甘薯新品種福寧紫4和5號(hào)成苗的一個(gè)主要影響因子，品種間對(duì)成苗影響不大，雖然MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.01～0.05 mg/L均可誘導(dǎo)其莖尖成苗，但以低濃度組合較合適，2個(gè)品種均以MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.01 mg/L組合為最佳，平均成苗率達(dá)70.8%。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)福寧紫4號(hào)和5號(hào)莖尖分生組織成苗率的影響

2.2 莖尖組培苗脫毒效果檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)指示植物進(jìn)行針刺汁液傳毒試驗(yàn)，陽(yáng)性對(duì)照6株帶病毒巴西牽牛植株，20 d后全都表現(xiàn)出褪綠、皺縮、明脈等癥狀，6株陰性對(duì)照植株不表現(xiàn)相應(yīng)癥狀。由表2可知，100個(gè)福寧紫5號(hào)莖尖無(wú)性系脫毒率達(dá)到了78.0%，獲得78個(gè)脫毒無(wú)性系；100個(gè)福寧紫4號(hào)莖尖無(wú)性系脫毒率達(dá)到了80.0%，獲得80個(gè)脫毒無(wú)性系。

表2 福寧紫4號(hào)和5號(hào)莖尖組培苗病毒檢測(cè)結(jié)果

2.3 脫毒苗快速繁殖試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，MS和1/2 MS培養(yǎng)基對(duì)福寧紫4號(hào)和5號(hào)脫毒組培苗生長(zhǎng)繁殖有極顯著影響，表現(xiàn)在莖節(jié)發(fā)生數(shù)量上，福寧紫4號(hào)脫毒組培苗單節(jié)莖段在1/2MS培養(yǎng)基上的月均繁殖系數(shù)為2.83倍，與MS培養(yǎng)基上2.29倍的月均繁殖系數(shù)相比達(dá)極顯著差異水平，生根時(shí)間比MS培養(yǎng)基提早6 d；福寧紫5號(hào)脫毒組培苗單節(jié)莖段在1/2MS培養(yǎng)基上的月均繁殖系數(shù)為2.41倍，與MS培養(yǎng)基上2.10倍的月均繁殖系數(shù)相比達(dá)顯著差異水平，生根時(shí)間比MS培養(yǎng)基提早7 d。因此1/2MS培養(yǎng)基適合福寧紫4號(hào)和5號(hào)組培苗的切段快繁，該培養(yǎng)基上脫毒組培苗發(fā)根時(shí)間早，生長(zhǎng)健壯，繁殖率較高。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)福寧紫4號(hào)和5號(hào)脫毒苗生長(zhǎng)繁殖的影響

2.4 脫毒種薯的田間測(cè)產(chǎn)結(jié)果

對(duì)福寧紫4號(hào)、5號(hào)脫毒種薯苗和未脫毒種薯苗進(jìn)行田間測(cè)產(chǎn)，結(jié)果顯示，福寧紫4號(hào)脫毒種薯苗可比未脫毒種薯苗（CK）增產(chǎn)11.60%，達(dá)到極顯著差異；福寧紫5號(hào)脫毒種薯苗可比未脫毒種薯苗（CK）增產(chǎn)5.27%，達(dá)到顯著差異（表4）。

表4 福寧紫4號(hào)和5號(hào)脫毒苗對(duì)產(chǎn)量的影響

3 結(jié)論

福寧紫4號(hào)和5號(hào)莖尖初代培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L，成苗率達(dá)70.8%。莖切段繼代增殖適宜培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基（大量、微量元素減半），福寧紫4號(hào)月均繁殖系數(shù)達(dá)2.83倍（即每60 d每株組培苗可切成5.66節(jié)進(jìn)行繁殖），福寧紫5號(hào)月均繁殖系數(shù)達(dá)2.41倍（即每60 d每株組培苗可切成4.82節(jié)進(jìn)行繁殖）；福寧紫4號(hào)脫毒種薯苗產(chǎn)量比未脫毒種薯苗提高11.60%，達(dá)到極顯著水平；福寧紫5號(hào)脫毒種薯苗產(chǎn)量比未脫毒種薯苗提高5.27%，達(dá)顯著水平。運(yùn)用莖尖離體培養(yǎng)培育的福寧紫4號(hào)和5號(hào)脫毒種薯苗，田間增產(chǎn)顯著。

4 討論

甘薯為無(wú)性繁殖作物，田間易被多種病毒復(fù)合侵染并累積，病毒傳播主要有粉虱、蚜蟲(chóng)、機(jī)械摩擦、種苗交換等多種方式。喬奇等[14]報(bào)道，福建檢出甘薯病毒6種；Xie等[15]報(bào)道，福建檢出甘薯病毒有7種；鄒為坤[16]報(bào)道，福建檢出甘薯病毒有11種；李華偉等[3]從福建7個(gè)甘薯產(chǎn)區(qū)鑒定12種甘薯病，連續(xù)幾年的甘薯病毒病調(diào)查結(jié)果表明，由于區(qū)試等甘薯種苗交換，福建省甘薯病毒病的發(fā)生呈現(xiàn)以泉州為中心，向其他甘薯產(chǎn)區(qū)逐漸擴(kuò)散，呈現(xiàn)從南到北的蔓延并逐年加重的趨勢(shì)。為防止甘薯病毒的傳播蔓延導(dǎo)致品種退化，必須利用甘薯莖尖分生組織離體培養(yǎng)獲得脫毒種苗，并對(duì)原品種進(jìn)行更新?lián)Q代，加強(qiáng)種苗質(zhì)量監(jiān)控，才能防止病毒的傳播。

本試驗(yàn)在福寧紫4號(hào)和5號(hào)脫毒組培苗誘導(dǎo)過(guò)程中，添加了低濃度的NAA和6-BA的MS培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)莖尖成苗，其中6-BA是影響莖尖成苗的主要因子，適宜濃度為0.1 mg/L；NAA是影響莖尖誘導(dǎo)成苗的次要因子，其適宜濃度在0.01～0.02 mg/L。培養(yǎng)基中6-BA的濃度不宜高于0.1 mg/L，NAA濃度不宜高于0.02 mg/L，否則莖尖易愈傷組織化，不易生長(zhǎng)成苗。另外，福寧紫4號(hào)和5號(hào)脫毒苗可采用莖切段繼代增殖，增殖培養(yǎng)基采用1/2MS基本培養(yǎng)基，莖段早發(fā)根，月均繁殖倍數(shù)高于MS培養(yǎng)基。

福寧紫4號(hào)和5號(hào)脫毒種薯在大田生產(chǎn)過(guò)程中，為提高種薯繁殖效率，可利用大棚苗床提早定植并多次剪蔓扦插繁殖。經(jīng)大田栽培測(cè)產(chǎn)試驗(yàn)表明，脫毒種薯苗田間長(zhǎng)勢(shì)好，產(chǎn)量顯著提高，可應(yīng)用于田間生產(chǎn)和種苗交換。