蛹蟲草菌糠制備蟲草肽酵素飲料的研究

雷燕妮，張小斌，楊 梅，陳書存，陳冬平，李多偉,6

(1.商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000；2.陜西秦嶺特色生物資源產業技術研究院，陜西 商洛 726000；3.商洛學院 健康管理學院, 陜西 商洛 726000；4.西安宇沐生物技術研究院有限公司，陜西 西安 710068；5.商洛市中醫醫院，陜西 商洛 726000；6.西北大學 生命科學學院，陜西 西安 710069)

蛹蟲草是一種大型藥食用真菌，其體內所含的蟲草素經過科學的檢查和實驗發現，能夠有效的抑制細菌的滋生，并且還能抵抗病毒，遏制腫瘤生長[1～3]，降低高血糖患者體內的血糖含量，醫學作用十分巨大[4]；而其所含的蟲草多糖同樣也具很強的保健功效和醫藥價值，比如說皮膚抗皺、延緩機體衰老、提高免疫力及增加抗癌能力，對于患有癌癥的病人也有一定的遏制病情發展的能力。蛹蟲草人工栽培過程中有大量廢棄的菌糠產生，目前，食用菌菌糠主要用于加工飼料或生產有機肥料。而且經過研究和分析得到，即使無法作為藥品使用的廢棄菌糠內也會還有一定量的蟲草素和蟲草多糖，除此之外還有大量的具有價值的物質[5]，如蛋白質、脂肪酸等等。蛹蟲草菌糠有別于其他食用菌菌糠，在蛹蟲草栽培中完全采用食品如大米、小麥和蠶蛹粉等，無其他抗菌、殺菌的化學添加劑成分，因此，蛹蟲草菌糠在食品、飲品中應用將會具有很好的經濟效益[6]。

目前，市場上流通的受到很多消費者喜愛的保健品一般原料都是酵素，酵素是將水果或蔬菜在有益菌的幫助下進行發酵，而完成發酵后的產物將會具有多種對人體有益的微生物，即人們所說的酵素。關于酵素的作用，除了最常見的延緩衰老、增強免疫力、抑制細菌滋生、凈血等保健功效外，還有消炎、抗癌等醫學功效，因此其十分受消費者的喜愛[7，8]。不過，對于將菌糠制作成為飲料這一方式，并沒有豐富的研究資料可供參考，也沒有專業的研究所對其進行充分的實驗。筆者研究為能夠實現酵素飲料的大面積生產提供一定的參考價值，開辟出新的菌糠利用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與設備

1.1.1 材料 蛹蟲草菌糠：由徐州鴻宇農業科技有限公司提供；果膠酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶：南寧東恒華道生物科技有限責任公司,MRS固體培養基,MRS液體培養基,安琪高活性果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳桿菌:陜西省微生物所提供。

1.1.2 儀器與設備 植物粉碎機(FZ102)；冰箱(BCD-245/H)；高壓蒸汽滅菌鍋(SX-280A、上海申安醫療器械廠)；超凈工作臺(SW-CJ)；超聲清洗器(KQ-50DB)；磁力加熱攪拌器(DF-10IS)；恒溫振蕩器(THZ-92A、上海博迅公司)；紫外可見分光光度計(UV-1700)；電子分析天平(SPS202F)；電熱鼓風干燥箱( DHG-9070A)及電熱恒溫培養箱(DNP-9052A)均采購自上海鴻都電子科技有限公司；高速離心機(LD5-10、北京醫用離心機廠)；蒸餾水器(DE-10、上海悅豐)；手動單道可調式移液器(PotPette 100-1000μl、上海大龍醫療器械有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.2 操作要點 主要有:

(1)蛹蟲草菌糠肽液的制備。選取無污染的蛹蟲草菌糠粉碎成粗粉，按料液比1∶10、1∶8煮提，煮提時間120 min、90 min，煮提液過濾，用20%鹽酸溶液或20%的氫氧化鈉溶液調節煮提液pH至 6.5左右，按體積比加入1‰中溫型α-淀粉酶,于60～70℃水解2 h，除去煮提液中的淀粉(產品中過多淀粉的存在會嚴重影響酵素減肥的功效)，在用20%鹽酸溶液或20%的氫氧化鈉溶液調節淀粉酶水解液pH至7.5左右，按體積比加入1‰植物蛋白酶(如菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶等)，35～45℃酶解3 h，使淀粉酶水解液中蟲草蛋白水解為蟲草蛋白肽，制成蛹蟲草菌糠肽液，低溫保存備用。

(2)發酵液的接種和發酵。取蛹蟲草菌糠肽液200 mL于500 mL三角瓶中，121℃滅菌30 min，待滅菌液溫度降至30℃以下時接入3%～5%的乳酸菌菌液，有氧發酵30～36 h，在接入0.10%～0.15%的酵母菌菌液繼續發酵24～36 h。通過不同的參數組合得出在不同接種量、發酵問題、發酵時間等條件下，乳酸菌和酵母菌數量的變化，以及常規pH、SOD酶的活性、產物酸度數值等參數的變化。

(3)蛹蟲草菌糠肽酵素飲料的制備 上述工藝制得的蛹蟲草菌糠肽酵素液，用檸檬酸和甜菊糖調配酵素液口感。通過加入含量的不同從而得到口感和氣味不同的產品，并利用全因子實驗獲得具體的加入量，再以感官評定確定某一組的測試者評分。

1.2.3 測定方法 主要有:

(1)酵素液中酵母菌含量的測定,按照GB 4789.15-2016 操作。

(2)酵素液中乳酸菌含量的測定,按照GB 4789.35-2016操作。

(3)酵素液中S0D活性的測定,按照GB/T 5009.171-2003操作。

(4)酵素液中酸度的測定方法, 按照GB/T 12456-2008操作。

(5)酵素液中pH的測定方法,按照GB/T 12456-2008操作。

2 結果與討論2.1 酵母菌發酵條件的優化

在單因素對發酵影響實驗的基礎上，為進一步探討各工藝條件相互交叉對發酵的影響，我們以SOD活性為指標,選擇酵母菌接種量(A)、發酵溫度(B)、發酵時間(C)3個因素,每個因素選擇3個水平,按正交試驗L9(33)表進行實驗, 通過正交試驗考察酵母菌發酵的最佳工藝參數，發酵正交實驗因素水平表和結果分析表見表1。

表1 正交L9(33)及結果分析

表1極差分析可以看出，B>A>C為各因素對SOD活性影響的順序。對于酵母菌來說，發酵溫度最為重要，其次是菌的接種量和發酵時間。根據全部實驗中得出的最佳組合A3B3C2即接入0.15%的酵母菌后，在30℃的條件下發酵15 h，即可得到最佳的酵母菌發酵產物。

2.2 乳酸菌發酵條件的優化

在單因素對發酵影響實驗的基礎上，為進一步探討各工藝條件相互交叉對發酵的影響，我們以酸度為指標,選擇乳酸菌接種量(A)、發酵溫度(B)、發酵時間(C)3個因素,每個因素選擇3個水平,并按照實驗表安排數值進行正交試驗，以此來確定最佳的乳酸菌發酵工藝參數。具體數值安排和實驗結果如下表：

表2極差分析可以看出，A>C>B為各因素對酸度影響的順序。對于乳酸菌來說，接種量的影響相對于兩者是最主要的，而發酵的溫度改變并不會對結果產生較大的影響。根據最優全部實驗總結出的最優組合為A3B1C2即接入6%的乳酸菌后在30℃的條件下發酵35 h，就可以得到最優的乳酸菌發酵產物了。

表2 正交L9(33)及結果分析

2.3 復合菌發酵結果

在利用蛹蟲草菌糠肽液進行發酵的過程中，使用了多種發酵菌，因此要根據不同菌種的營養吸收速率安排出不同的發酵時間和發酵條件，從得到的多個實驗組中挑選出最佳的一組。總發酵時間定為40 h，發酵條件為充分溶氧、為菌種選擇最合適的溫度、最佳pH的條件下，分別先后接入乳酸菌和酵母菌進行發酵研究其不同接種時間對乳酸菌和酵母菌數量的變化以及常規PH、SOD酶的活性、產物酸度數值等參數的變化的影響，具體的試驗因素及結果見表3。

表3 復合菌發酵試驗結果

表3可以看出，SOD活性高的為試驗2號和3號，試驗2號SOD活性已達到452.05 U·g-1，為最高值;試驗1～4號以達到工廠生產要求即酸度都達到0.50%以上，試驗1號已達到0.58%，為最高值。

2.4 蛹蟲草肽酵素飲料調配結果

取發酵蛹蟲草菌糠肽液適當稀釋，按適當比列加入甜菊糖、檸檬酸進行飲料的口感調配。根據評分方法(表4)進行效果評價，之后將加入的因素水平表和結果總結至表5。

表4 蛹蟲草肽酵素飲料的感官評分標準

表5 蛹蟲草肽酵素飲料調配全因子試驗結果

從蛹蟲草肽酵素飲料調配全因子試驗結果可得到，當添加量為0.1%的甜菊糖，0.3%檸檬酸時，所獲得的評分是全部實驗中最高的。

表5感官評定可以看出，實驗號2味道合適，但氣味并不十分明顯；實驗號4則氣味和味道都是不特別的突出；實驗號3經過測試者品嘗使用后，發現不僅味道可口，而且香氣撲鼻；試驗5～8號蛹蟲草肽酵素飲料風味太濃郁。所以說，制作成實驗號3的方式是最合適的生產方式，不僅口味獨特，而且伴有濃郁的蛹蟲草香味，經酸糖調配獲得風味適宜并伴有濃郁蟲草香味的酵素飲料。

2.5 產品指標

2.5.1 感官指標 氣味：具有明顯的蟲草味和發酵氣味；色澤：以金黃色為最佳；口感：無異味且酸甜度合適，口感綿柔順滑；質地：無雜質、沉淀、分層情況的出現，應是澄清的金黃色液體。

2.5.2 理化指標 總酸>0.35%；pH 3.0～4.0；可溶性固形物≤10%。

2.5.3 微生物指標 乳酸菌活菌數≧12.8×109CFU·mL-1；細菌總數(個·mL-1)≤100；大腸桿菌(個·L-1)≤3；致病菌未檢出。

3 結論

根據以上的分析可知，由于菌類其本身具有不同的特性，所以說如何滿足其發酵條件以及安排發酵時間是最主要的調配酵素飲料的技術難關，而筆者研究經過試驗測得的最佳發酵安排：第一步是在30℃的條件下，加入6%的植物乳桿菌發酵30 h，第二步在第一步的乳酸菌發酵完成后再加入0.15%的酵母菌發酵10 h，溫度仍為30℃保持不變。

蛹蟲草肽酵素飲料調配最佳配比為用0.1%的甜菊糖和0.3%的檸檬酸對蛹蟲草肽酵素進行調配，可獲得風味適宜，酸甜可口、且伴有濃郁的蟲草香味的蛹蟲草肽酵素飲料。